donde a es la rotación observada, l  la longitud en dm de la capa observada, c el número de gramos de sustancia contenidos en 100 ml de solución, d la densidad y p el número de gramos de sustancia contenidos en 100 g de solución. En la determinación de la rotación específica de un compuesto debe especificarse el disolvente empleado y la concentración, además del tipo de luz utilizada (línea D del sodio de 589,3 nm o línea verde del mercurio de 546,1 nm), por ejemplo (2,0 % en etanol) = -15°.

Para ver ejemplos del uso del poder rotatorio específico como constante física, pueden consultarse monografías de BP u otras farmacopeas sobre sales de alcaloides.

El polarímetro visual requiere el empleo de soluciones no fuertemente coloreadas y sin opacidad alguna; a veces, cuando se trata de extractos de plantas, tales soluciones son difíciles de obtener. Como la rotación angular disminuye linealmente, mientras que la absorción lo hace exponencialmente, al disminuir la longitud del trayecto recorrido por el rayo luminoso, el empleo de tubos cortos para la muestra es una evidente ventaja, siempre que sea posible medir exactamente las pequeñas rotaciones correspondientes. El Polarímetro Automático BendixNPL tiene un tubo de un décimo aproximadamente de la longitud del que requiere el polarímetro visual. La medición de pequeñas rotaciones se hace posible aprovechando el efecto electro‑óptico de Faraday: rotación del plano de un rayo de luz polarizada en un campo magnético, siendo el grado de rotación proporcional a la intensidad del campo. El instrumento se pone a cero por medio de dos solenoides, a través de los cuales pasa el rayo de luz polarizada. La inserción de una solución ópticamente activa entre los solenoides, proporciona una señal registrable (-) o (+), que es generada por un fotomultiplicador al final del recorrido de la luz.

DETERMINACIONES QUIMICAS CUANTITATIVAS. Varias determinaciones químicas cuantitativas ‑índice de ácido, índice de yodo, índice de saponificación, índice de éster, materia insaponificable, índice de acetilo, acidez volátil‑, se aplican principalmente a los aceites fijos y se mencionan en el Capítulo 24. Algunas de estas determinaciones son también útiles en la valoración de resinas (índice de ácido, cenizas sulfatadas), bálsamos (índice de ácido, índice de éster, índice de saponificación) y gomas (determinación de metoxilos, acidez volátil).

ENSAYOS

Una droga puede ser ensayada respecto a un grupo concreto de componentes, como alcaloides totales en la belladona o heterósidos totales en la digital. Otras veces puede ser necesario determinar componentes específicos, como el contenido *en reserpina de Rauwofia spp, diferenciado de su contenido total en alcaloides. Los ensayos biológicos, que generalmente requieren largo tiempo, se emplean con drogas potentes, como la digital, cuando los ensayos químicos o físicos no existen o no indican la verdadera actividad de la droga. Los métodos espectrométricos, sobre todo combinados con la cromatografía, son en la actualidad de uso creciente y nos ocuparemos de ellos con mayor amplitud más adelante. En la Tabla 9 se relacionan algunos ejemplos de ensayos; en la mayoría de ellos es necesaria la purificación previa de los componentes activos.

ANALISIS ESPECTROSCOPICOS. Las vibraciones electromagnéticas utilizadas en el análisis espectroscópico pueden clasificarse aproximadamente por la longitud de onda en ultravioleta (185‑380 nm), visible (380‑780 nm), infrarrojo cercano (780‑3.000 nm) e infrarrojo (3‑40 m.m). El análisis espectroscópico se funda en la capacidad de ciertas moléculas de absorber vibraciones a longitudes de onda específicas. Así, la cadena lateral butenólida de los heterósidos cardiacos es responsable de una fuerte absorción a 215‑220 nm; los dobles enlaces conjugados del licopeno (un pigmento del tomate y otros frutos) dan un máximo de absorción de la luz a una longitud de onda de 470 nm, mostrando así un color rojo; el grupo carbonilo de las cetonas, ácidos carboxílicos y ésteres, origina una fuerte absorción en el infrarrojo aproximadamente a 5,7‑6,1 m.m. En las regiones ultravioleta y visible, el espectro, de absorción característico de una molécula es producido por cambios en los niveles de energía electrónica, asociados con varios grupos cromóforos de la molécula. Estos cambios suponen, la, absorción de cantidades relativamente grandes de energía (en quanta exactos) y también van acompañados de cambios en la energía de vibración y de rotación de la molécula. El resultado es un espectro de absorción en bandas sin máximos definidos. En comparación, el espectro de absorción de una molécula en la región del infrarrojo es mucho más complejo, debido a que aquí las energías producidas son demasiado pequeñas para provocar cambios electrónicos, pero lo suficientemente grandes para producir numerosos cambios de energía vibratoria y rotatoria. Cada uno de estos cambios va unido a una longitud, de onda característica y el espectro muestra una estructura mucho más fina que en las regiones visibles o ultravioleta. El espectro infrarrojo de una molécula puede dividirse en dos áreas: de un lado, la región de las «huellas digitales» (7‑11m.m), que es característica de la molécula en examen, pero en la cual es difícil asignar máximos a las vibraciones específicas; y el resto del espectro, en el que pueden reconocerse muchos grupos funcionales. El volumen 3 de la BP 1980 está dedicado a los espectros IR de los compuestos medicinales.

                                             Tabla 9. Tipos de ensayos empleados sobre drogas

Tipo de ensayo Ejemplos
Separación y pesado de componentes activos Colchicina en el bulbo y semillas de cólchico
Resinas de podofilo y de Convolvulaceae
Filicina bruta en el helecho macho
Acidos balsámicos totales del bálsamo del Perú
Químicos «Alcaloides totales» de muchas drogas (por ejemplo,
volumetrías ácido-base)
Valoraciones en medio no acuoso, de sales de
alcaloides
Estricnina en la nuez vómica
Morfina en el opio
Aldehído cinámico en la esencia de canela de Ceilán
Alcoholes libres en esencia de menta
Carvona en la esencia de alcaravea
Físicos Cineol en esencia de eucalipto (p.f. del complejo
o-cresol)
Espectrométricos, incluyendo colorimétricos La mayoría de los grupos de principios activos
y fluorescencia Drogas cardiactivas, antibióticos, vitaminas, tenicidas,
Biológicos derivados antraquinónicos, drogas midriáticas,
saponinas, drogas antitumorales
Radioinmunoensayo (RIE) Limonina (Citrus), cardenólidos (Digitales lanata),
loganina (cultivo de células vegetales), senósidos
(Cassia augustifolia); alcaloides tropánicos
(Solanaceae medicinales), morfina y alcaloides
relacionados (cápsulas de adormideras), derivados
del ácido lisérgico (cornezuelo de centeno), quinina
(cultivo de tejidos vegetales), ajmalina (Rauwolfia
spp.), vincristina y alcaloides relacionados
(Catharanthus roseus), solasodina (Solanum spp.)
Inmuno-enzimáticos Quasina, neoquasina, 18-hidroxiquasina (Quassia y
Picrasma spp.), alcaloides tropánicos (Solanaceae)

La BP utiliza las características de la absorción ultravioleta como estándares para la bencilpenicilina y numerosos alcaloides, como emetina, morfina, reserpina, cocaína, colchicina y cloruro de tubocurarina.

Si la luz de una determinada longitud de onda pasa a través de la solución de una sustancia, la transmisión es T= I / I0, donde I0 es la medida de la luz que llega al detector (una célula fotoeléctrica) cuando en el trayecto luminoso no existe más que disolvente, e I es la luz que llega al detector cuando se examina una solución de la sustancia a investigar. T se mide experimentalmente, pero el valor más útil es log10(I0 / I), densidad óptica decimal o, simplemente, densidad óptica (E). La densidad óptica, pero no la transmisión, es proporcional al número de unidades absorbentes en el recorrido de la luz. Para las soluciones, esto es la ley de Beer. El espectro de absorción de una sustancia pura, en condiciones determinadas de disolvente y temperatura, está constituido por una serie de valores de E, observados a diferentes longitudes de onda en una solución de concentración constante (un mol por litro), cuando el espesor de la capa atravesada por la luz es de 1 cm. Puede emplearse también cualquier otra solución de concentración conocida. Por ejemplo, para una solución al 1 % p/v, con un espesor de capa de 1 cm, la densidad óptica viene indicada por . Estos espectros de absorción tienen valor para la identificación, determinación de la estructura y pureza y para analizar los componentes. Algunas sustancias absorben luz ultravioleta de cierta longitud de onda y durante el período de excitación re‑emiten luz de una longitud de onda mayor y a menudo en la región visible. Este fenómeno es la fluorescencia; el espectro de fluorescencia es característico de las sustancias que lo producen. Las aplicaciones del análisis de fluorescencia se exponen después.

Para la valoración cuantitativa de una sustancia se prepara, de antemano, una curva‑patrón, por medición de las densidades ópticas de una serie de soluciones‑tipo del compuesto puro, empleando luz de longitud de onda conveniente; por lo general aquella a la que el compuesto dé un máximo de absorción. Para que cumplan la ley de Beer, las soluciones deben ser lo suficientemente diluidas. Una vez determinada la densidad óptica de la solución problema, se averigua su composición mediante la curva estándar. Los componentes individuales de una mezcla se pueden determinar por absorción ultravioleta siempre que presenten distintos máximos de absorción. Así, para la brucina y la estricnina, los valores de para las longitudes de onda (l) indicadas son:

Por medición de las extinciones de la solución de la mezcla de alcaloides a las longitudes de ondas señaladas, es posible utilizar un ensayo espectrofotométrico con dos puntos para la determinación de ambos alcaloides. Este método es oficial en la BP 1980 para el ensayo de las semillas de nuez vómica y sus preparaciones y reemplaza el antiguo método químico. Un tipo de ensayo similar es empleado por la EP para los alcaloides de tipo quinina y cinconina en la corteza de la quina; las medidas se efectúan a 316 y 348 nm. En ocasiones es útil examinar el espectro ultravioleta de una mezcla más compleja: así, la USP incluye un ensayo de absorbancia ultravioleta paró establecer la ausencia de esencias extrañas en las de limón y naranja y la BP establece un límite de extinción entre 268 y 270 nm para el aceite de ricino.

En la mayoría de los casos es esencial que no estén presentes sustancias que interfieran en las mediciones; éstas pueden ser especialmente perjudiciales en la región ultravioleta, sobre todo, para los productos extraídos de los cromatogramas en capa fina y papel. Por esta razón, si no se dispone de soluciones puras para la determinación, es a veces preferible utilizar algún tipo de técnica colorimétrica, en especial si la reacción empleada a fin de producir el color es altamente específica para el compuesto en consideración.

El análisis colorimétrico puede realizarse con un espectrofotómetro adecuado ‑la mayor parte de los instrumentos que operan en la región ultravioleta también permiten trabajar en la región visible‑; pero los colorímetros más sencillos en los que se emplean filtros apropiados para seleccionar las correctas longitudes de onda requeridas, son bastante satisfactorios para la mayoría de los fines. En estos instrumentos se emplea una fuente luminosa sencilla y entre la lámpara y la solución a analizar se halla un filtro que transmite la región de longitudes de onda absorbidas por el compuesto a determinar, es decir, un color complementario del que tiene la solución problema. La luz transmitida, medida por una célula fotoeléctrica, determina la composición de la solución por referencia a una curva patrón.

El máximo de absorción característico del espectro infrarrojo, aunque más complejo, puede utilizarse también en análisis cuantitativo, del mismo modo que las absorciones ultravioleta y visible. También pueden valorarse mezclas de sustancias; así, por mediciones a 9,80, 9,15 y 9,00 ¡¡m es posible determinar separadamente las saponinas esteroides epímeras 25a y 253, presentes en extractos vegetales (Brain, et al., Phytochemistry, 1968, 7, 1815). En la Tabla 10 constan algunos de los muchos ejemplos de aplicación del análisis espectrométrico a los componentes de las drogas.

 

Tabla 10. Algunos ejemplos de aplicación del análisis espectrométrico a los principios de las drogas

Región del Principios Longitud de onda para determinación
espectro de la densidad óptica
Ultravioleta Alcaloides:
Lobelina 249 nm
Reserpina 268 nm
Vinblastina 267 nm
Vincristina
Tubocurarina cloruro 280 nm
Morfina 286 nm
Colchicina 350 nm
Heterósidos cardioactivos
con cadena lateral
butenólida 217 nm
Cuasinoides 254 nm
Esencia de canela de China:
contenido de aldehído 286 nm
Esencia de bergamota:
contenido en bergapteno 313 nm
Acido flavaspídico
del helecho macho 290 nm
Capsaicina 248 y 296 nm
Vainilla 301 nm
Vitamina A (aceite de
hígado de bacalao) 328 nm
Visible Alcaloides:
Cornezuelo 550 nm utilizando el reactivo
(alcaloides totales) p-dimetilaminobenzaldehído
532 nm por reacción con vainillina en
clorhídrico concentrado
Morfina 442 nm mediante nitroso-reacción
Reserpina 390 nm por tratamiento del alcaloide con nitrito.
sódico en ácido diluido
Esteres del ácido trópico de 555 nm por tratamiento del alcaloide con ácido
hidroxitropanos nítrico fumante, seguido de evaporación a
sequedad y adición de solución metanólica de
hidróxido potásico a una solución acetónica
de residuo nitratado (reacción de Vitali-Morin)
Antraquinonas 500 nm después del tratamiento con álcali (ver
«Hoja de sen BP» para determinación de
senósido; también «Acíbar, cáscara sagrada y
ruibarbo») (515 nm)
530 nm para valor del color de la cochinilla
Capsaicina en pimiento 730 nm tras reacción con ácido fosfomolíbdico y
solución de hidróxido sódico
505 nm después de tratar con ácido
diazobencensulfónico en una solución al 10
de carbonato sódico
Heterósidos cardioactivos:
Basado en la molécula
de digitoxosa 590 nm mediante la reacción de
Keller-Kiliani
Basado en el anillo lactónico 620 nm por reacción con m-dinitrobenceno
Heterósidos cianogenéticos 630 nm por la reacción coloreada de la
(determinación de cianuro) piridinpirazolona
Taninos:
Ratania 750 nm, utilizando ácido fosfomolíbdico y
solución de carbonato sódico (ver BP)
Aceites esenciales:
Mentol en la esencia 500-570 nm (filtro verde), empleando
de menta reactivo p-dimetilaminobenzaldehído
Infrarrojo Alcaloides:
Mezclas de quinina
y estricnina 6,2 y 6,06 μm
Saponinas esteroides 11,11 y 10,85 lm; ver texto
Aceites esenciales:
o-Metoxicinamaldehído en Mediciones a 7,18 μm y 7,62 pm para
esencia de canela de China distinguir la esencia de la corteza de las
esencias de hojas y ramas
Agua 1,9 lim específico para agua, sin interferencia
de otros grupos -OH

ANALISIS DE FLUORESCENCIA. Muchas sustancias (por ejemplo, la quinina en solución de ácido sulfúrico diluido), convenientemente iluminadas, emiten luz de diferente longitud de onda o color de la que incide sobre ellas. Esta luz emitida (fluorescencia), cesa cuando se elimina la luz excitante.

Los ensayos analíticos basados en la fluorescencia con luz natural no se emplean mucho, ya que son generalmente irrelevantes por la debilidad del efecto fluorescente. Una excepción de esto es el conocido ensayo de la umbeliferona, que puede aplicarse a la gomorresina amoniaco, al gálbano y a la asafétida. Puede prepararse una solución fuertemente fluorescente de umbeliferona hirviendo gálbano con ácido y filtrando sobre un exceso de amoniaco alcohólico. Otras soluciones fluorescentes son las de quinina (en ácido diluido), esculina (por infusión de corteza de castaño de Indias), clorofila (de hojas de ortiga o de perejil), b‑naftol (disuelto en álcali) y soluciones acuosas de los colorantes eosina y fluoresceína.

Una generalización muy importante, realizada por Stokes en 1852, estableció que «en la fluorescencia, la luz fluorescente es siempre de mayor longitud de onda que la luz excitante». La luz rica en longitudes de onda corta es muy activa en cuanto a la producción de fluorescencia y, por esta razón, la luz fuertemente ultravioleta (como la que se obtiene del arco de wolframio o de la lámpara de vapor de mercurio) produce fluorescencia en muchas sustancias que no dan fluorescencia visible a la luz natural. Las lámparas de fluorescencia están generalmente provistas de un filtro adecuado que elimina la radiación visible de la lámpara y transmite la radiación ultravioleta de la longitud de onda deseada. Para observaciones cromatográficas se dispone de lámparas manuales de ultravioleta de ondas larga y corta; es de la mayor importancia que los ojos estén adecuadamente protegidos en presencia de las radiaciones ultravioleta.

Para su examen, los sólidos pueden ponerse directamente bajo la lámpara, mientras que los líquidos han de examinarse en cápsulas o tubos de ensayo no fluorescentes, o mediante el depósito de gotas en papel de filtro. Muchos alcaloides en estado sólido muestran colores diversos, como aconitina (azul claro), berberina (amarillo) y emetina (anaranjado). Si se ponen bajo la lámpara fragmentos de corteza de quina, muestran numerosas ínanchas amarillas luminosas y algunas en azul claro. Si se toca la superficie interior de la corteza con ácido sulfúrico diluido, la mancha pasa inmediatamente a azul. La raíz de ipecacuana posee un aspecto luminoso brillante, donde quiera que el leño sea expuesto, mientras que el leño del rizona de hidrastis brilla con un amarillo oro. La nuez de areca, partida, muestra un endospermo azul claro. Las taleolas de colombo aparecen intensamente amarillas, distinguiéndose el cambium y el floema por su color verde oscuro. Las cretas precipitadas y preparadas pueden distinguirse fácilmente unas de otras.

La mayoría de los aceites, grasas y ceras muestran cierta fluorescencia al examinarse a la luz ultravioleta filtrada. En términos generales exhiben escasa fluorescencia los aceites fijos y las grasas, más fuertes las ceras, y más que todos, los aceites minerales (parafinas).

Los polvos pueden examinarse macroscópicamente como queda dicho o microscópicamente por medio de un microscopio de fluorescencia. En relación a las drogas pulverizadas, puede mencionarse la detección de cornezuelo en harina, de cáscaras de cacao en el cacao pulverizado y de Rumex en la genciana pulverizada. Diversas variedades de ruibarbo pueden distinguirse unas de otras. Maheu describe el Rheum officinale, R. tanguticum y R. emodi como poseedores de una fluorescencia parda, mientras que los Rheum compactum, R. undulatum, R. ribes y R. rhaponticum muestran color violado. Las diferencias de color que existen en tales casos, aunque fácilmente preceptibles para el observador, son sumamente difíciles de expresar en palabras; y también ocurre con frecuencia que la exposición continuada a la luz ultravioleta afecta al color e intensidad de la fluorescencia. La BP de 1973 recogía un ensayo de fluorescencia sobre droga entera o pulverizada para la detección del rapóntico, ensayo que en la actualidad ha sido sustituido por otro, consistente en una cromatografía en capó fina.

En el examen de cromatogramas en papel y capa fina se emplea mucho la luz ultravioleta para la localización de los compuestos separados; en el Capítulo 20 se citan algunos ejemplos. Con los extractos de plantas es conveniente observar el cromatograma a la luz ultravioleta, incluso cuando los componentes que se están investigando no son por sí mismos fluorescentes. En este sentido puede ser revelada la presencia de impurezas fluorescentes que, si no se ponen de manifiesto, pueden interferir con el posterior análisis de absorción. A veces puede emplearse la supresión de la fluorescencia para localizar sustancias no fluorescentes sobre cromatogramas en capa fina. Para ello se produce un fondo fluorescente al ultravioleta, mediante una pequeña cantidad de una sustancia inorgánica fluorescente, en la capa fina. Las sustancias separadas producen una supresión local de la fluorescencia del fondo y aparecen, por tanto, manchas oscuras sobre un fondo coloreado.

Análisis de fluorescencia cuantitativo. Esta técnica utiliza la fluorescencia producida por un compuesto a la luz ultravioleta, para su determinación cuantitativa. El instrumento empleado es un fluorímetro, constituido por una fuente ultravioleta adecuada y una célula fotoeléctrica para medir la intensidad de la luz fluorescente emitida. Entre ciertos límites, la intensidad de la fluorescencia de un producto dado está relacionada con su concentración. Es usual seleccionar un estrecho margen de longitudes de onda para la medición, poniendo un filtro entre la solu­ción fluorescente y la célula fotoeléctrica. La concentración de una sustancia en solución se obtiene por referencia a una curva‑patrón, construida sometiendo soluciones‑tipo al proceso fluorimétrico. Con extractos de plantas es importante el asegurarse de que: 1) la sustancia a determinar es la única que produce en la solución una fluorescencia a la longitud de onda medida; 2) la ausencia de sustancias en la solución que absorban luz a la longitud de onda de la fluorescencia. En la actualidad se dispone de instrumentos sensibles en los que el espectro de fluorescencia se analiza automáticamente y en los que se puede variar también la longitud de onda de la radiación incidente.

La quinina puede ser adecuadamente determinada mediante medición de la fluorescencia azul (366 nm), producida por irradiación del alcaloide en una solución de ácido sulfúrico diluido, a unos 450 nm. El método puede ser utilizado para la determinación de quinina en presencia de otros alcaloides (estricnina, por ejemplo). El sen de Alejandría se ha analizado por medición de la fluorescencia producida en la reacción de Bornträger en condiciones determina­das. El contenido en hidrastina de la raíz de hidrastis puede determinarse por oxidación de un extracto de la droga con ácido nítrico y medición de la fluorescencia de la hidrastinina produci­da; por este método, la berberina y la canadina, que son otros alcaloides del hidrastris, quedan excluidos del ensayo. La emetina y la papaverina pueden determinarse fluorimétricamente, mediante oxidación con permanganato ácido; la noscapina, tras oxidación con persulfato. En mezclas de heterósidos cardiacos es posible separar los componentes, mediante cromatografía en papel (q.v.) y medir la fluorescencia de los heterósidos separados, tras adecuada nebuliza­ción para su revelado, e irradiación con luz ultravioleta. También pueden eluirse los heterósi­dos individualmente con disolventes adecuados, para luego medir las fluorescencias de las soluciones. Entre los diversos métodos de valoración de la reserpina en especies de Rauwofia, existe uno basado en la fluorescencia verde, producida cuando la reserpina en ácido acético se oxida con peróxido de hidrógeno. También se han registrado métodos fluorimétricos para la determinación de los alcaloides del cornezuelo, umbeliferona, aflatoxina y diversos fármacos en líquidos biológicos.

TANDEM DE ESPECTROSCOPIA DE MASA (EM‑EM). Hasta hoy, en el campo de la fitoquí­mica, se ha solido asociar la espectroscopia de masa, más con la dilucidación de compuestos que con su determinación. No obstante, mediante el empleo simultáneo de dos espectrómetros de masa en serie, es posible determinar cuantitativamente la cantidad de un determinado compuesto en mezclas complejas, extractos de plantas o incluso en plantas desecadas. Plattner y Powell, en su comunicación sobre identificación de maitansinoides (J. Nat. Prod., 1986, 49, 475) califica la técnica como una importante herramienta analítica, para problemas de buscar analíticamente «una aguja en un pajar» La sensibilidad de los compuestos estudiados respecto a los picos puede realizarse con alta especificidad y respuesta casi instantánea; en cuanto a sensibilidad, es comparable al RIE, pero de mucho más rápida ejecución. El método ha sido utilizado para análisis de cocaína en plantas, pirrolizidina en Senecio y otros géneros, aflatoxina B , en aceite de cacahuete, xantonas, esteroides y antibióticos. La quimiotaxonomía de las Cactaceae, se ha investigado mediante esta metodología. Para detalles respecto al método, ver uno de los primeros trabajos sobre el tema: McLaferty, F. W. Science, 1981, 214, 280. Hasta ahora, la naturaleza del instrumental requerido más bien impide el considerar el método como de rutina analítica.

MICROSCOPIA CUANTITATIVA. Las drogas pulverizadas o los adulterantes que contienen una cantidad constante en número, área o tamaño, de partículas características / mg (por ejemplo: granos de almidón, epidermis, pelos, nerviaciones) pueden determinarse cuantitativamente por microscopía, utilizando esporas de licopodio como diluyente indicador. El método, antes ofi­cial en la BP, se describe en el Capítulo 44.

BIBLIOGRAFIA

Wagner, H., Bladt, S., y Zgainski, E. M. (1984). Plant Drug Analysisa Thinlayer Chromatography Atlas (170 fotos coloreadas), (trad. T. A. Scott). New York: Springer‑Verlag.

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*      La Resonancia Magnética Nuclear (RMN), se ve también representada con las siglas NMR, del inglés Nuclear Magnetic Resonance.