Difusión

Una banda de soluto se ensancha a medida que pasa por una columna cromatográfica. Teóricamente, una banda infinitamente estrecha en la entrada de la columna sale de ella en forma de una gaussiana (figura 23.11). En circunstancias menos ideales, la banda se hace asimétrica.

Una causa importante del ensanchamiento de banda es la difusión. El coeficiente de difusión mide la velocidad a que se mueve al azar una sustancia desde una región de mayor concentración a otra de menor concentración. La figura 23.12 muestra la difusión espontánea de un soluto a través de un plano con un gradiente de concentración dc/dx. El número de moles que atraviesa un metro cuadrado por segundo, llamado flujo (J) es pro­porcional al gradiente de concentraciones:

Fundamento físico de la cromatografía. Cuanto mayor es el cociente de coeficientes de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria, mayor es la separación entre los componentes de una mezcla.

La constante de proporcionalidad (D) es el coeficiente de difusión, y el signo negativo indica que el flujo se produce de la región de mayor concentración a la de menor concentración. En la tabla 23.1 figuran algunos coeficientes de difusión representativos. La difu­sión en líquidos es 104 veces menor que la difusión en gases. La macromoléculas, como la ribonucleasa y la albúmina, se difunden a una velocidad de 10 a 100 veces menor que las moléculas pequeñas.

Si un soluto empieza a pasar por la columna en forma de una capa infinitamente estre­cha de m moles por unidad de área de sección transversal de la columna, y se dispersa por mecanismos de difusión a medida que atraviesa la columna, el perfil gaussiano de la banda se puede describir mediante la ecuación

Tabla 23.1 • Coeficientes de difusión representativos a 298 K

Soluto

Disolvente

Coeficiente de difusión (m2/s)

H20

H20

2,3 x 10-9

Sacarosa

H20

0,52 x 10-9

Glicina

H20

1,1 x 10-9

CH30H

H20

1,6 x 10-9

Ribonucleasa (PM 13 700)

H20 (293 K)

0,12 x 10-9

Albúmina de suero (PM 65 000)

H20 (293 K)

0,059 x 10-9

I2

Hexano

4,0 x 10-9

CCI4

Heptano

3,2 x 10-9

N2

CCI4

3,4 x 10-9

CS2(g)

Aire (293 K)

1,0 x 10-9

O2(g)

Aire (273 K)

1,8 x 10-9

H+

H20

9,3 x 10-9

OH-

H20

9,3 x 10-9

Li+

H20

9,3 x 10-9

Na+

H20

9,3 x 10-9

K+

H20

9,3 x 10-9

Cl-

H20

9,3 x 10-9

1-

H20

9,3 x 10-9

donde c es la concentración (mol/m3), t es tiempo y x distancia a lo largo de la columna a partir del centro actual de la banda. (El centro de la banda siempre es x = 0 en esta ecuación.) Comparando las ecuaciones 23.5 y 4.3 se ve que la desviación estándar de la banda es

Altura de plato: Una medida de la eficacia de una columna

La ecuación 23.26 nos dice que la desviación estándar del ensanchamiento de la banda por difusión vale . Si un soluto ha recorrido una distancia x a una velocidad de flujo lineal ux (m/s), el tiempo que ha estado en la columna es t = xlux. Por tanto,

La altura de plato es la constante de proporcionalidad entre la varianza (σ2) de la banda y la distancia que ha recorrido (x). El nombre está tomado de la teoría de destila­ción, en la que la separación se lleva a cabo en pasos discretos llamados platos. La altura de plato también se llama la altura equivalente a un plato teórico. En cromatografía no existen "platos" físicos, de manera que se debe considerar la altura de plato como un tér­mino que relaciona la anchura de una banda con la distancia que ha recorrido a través de la columna. Cuanto más pequeña es la altura de plato, más estrecha es la banda.

La anchura de banda es Si el

tiempo de elución aumenta en un

factor de 4, la difusión ensanchará la

banda en un factor de 2.

 
 

uv = caudal (volumen/tiempo)

uX = velocidad lineal de flujo (distan-

cia/tiempo)

 
 

El término altura de plato procede de

la teoría de separaciones por destila-

ción. Algunas columnas de destila-

ción de gran eficacia se construyen

por medio de unidades discretas lla-

madas platos, en cada uno de los

cuales se equilibran entre sí el líquido

y el vapor. Siendo aún un adoles-

cente, A. J. P Martin, coinventor de la

cromatografía de reparto, construyó

columnas de destilación a base de

secciones discretas a partir de botes

de café. (No sabemos lo que desti-

laba.) Cuando formuló la teoría de la

cromatografía de reparto, adoptó tér-

minos de la teoría de destilación.

 
 

Pequeña altura de plato ocasiona

picos estrechos y esto ocasiona

mejores separaciones.

 
 

Escoger un pico con factor de capa-

cidad mayor que 5 cuando se miden

alturas de plato de una columna.

 
 

Cuestión a resolver Si N es cons-

tante, demostrar que la anchura de

un pico cromatográfico aumenta al

aumentar el tiempo de retención. Es

decir, los picos sucesivos de un cro-

matograma se deben hacer cada vez

más anchos.

     La capacidad de una columna para separar componentes de una mezcla mejora al disminuir la altura de plato. Decimos que una columna eficaz tiene más platos teóricos que una columna ineficaz. Los distintos solutos que pasan a través de una misma columna tienen diferentes alturas de plato, porque tienen diferentes coeficientes de difusión. Las altu­ras de plato en cromatografía de gases valen entre 0,1 y 1 mm, en cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) valen aproximadamente 10 m, y en electroforesis capi­lar, menos de 1 m.

     La altura de plato es la longitud σ2/x, donde σ es la desviación estándar de la banda gaussiana de la figura 23.9 y x es la distancia recorrida a través de la columna. Para un soluto que sale de una columna de longitud L, el número de platos teóricos (N) en toda la columna es la longitud L dividida por la altura de plato:

donde x = L y σ = w/4. En esta expresión, w tiene unidades de longitud y el número de pla­tos es adimensional. Si expresamos L y w (o σ ) en unidades de tiempo en lugar de longitud, N sigue siendo adimensional. Se obtiene la expresión más útil de N de la siguiente forma.

donde tr es el tiempo de retención del pico y w es la anchura en la base en la figura 23.9 en unidades de tiempo. Si usamos la anchura a la mitad de altura en lugar de la anchura en la base, resulta:

Ejemplo 23.6

Medida de platos

Un soluto con un tiempo de retención de 407s tiene una anchura en la base de 13 s en una columna de 12,2 m de longitud. Hallar el número de platos y la altura de plato.

SOLUCIÓN

Para estimar el número de platos teóricos de un pico asimétrico, como el de la figura 23.13, trazar una línea horizontal a través de la banda a 1/10 de la altura máxima. Las can­tidades A y B se pueden medir, y el número de platos es4

donde w0.1 es la anchura a 1/10 de la altura (A + B).

Se deben medir todas las cantidades

en las mismas unidades, en minutos

o en centímetros del papel de regis-

trador.

Factores que influyen en la resolución

Cuanto mayor es la resolución (ecuación 23.23), mejor es la separación entre dos picos. La relación entre el número de platos de una columna y la resolución es 5

donde N es el número de platos teóricos en la columna, α es la retención relativa de los dos picos (ecuación 23.15), 2 es el factor de capacidad del componente más retenido (ecuación 23.16) y k’pr es el promedio de los factores de capacidad de ambos componen­tes. Si el número de platos de dos picos no es el mismo (por ejemplo, N1 y N2) hay que sustituir N por

Un rasgo importante de la ecuación 23.30 es que la resolución es proporcional a . Por tanto, duplicando la longitud de la columna la resolución aumenta en . La ecuación 23.30 nos dice también que la resolución aumenta al aumentar α , y asimismo al aumentar el factor de capacidad 2 . Para cambiar la retención relativa, α , hay que cambiar la fase esta­cionaria en cromatografía de gases o bien la fase estacionaria y la fase móvil en cromatografía de líquidos. Recordemos que a está relacionada con los coeficientes de reparto de los dos solutos en las dos fases (ecuación 23.20). Por eso variando la naturaleza de las fases, varía α . Un aumento del factor de capacidad, 2, también determina un aumento de resolución. Aumentar el factor de capacidad es el equivalente a aumentar la fracción de tiempo que pasa un soluto en la fase estacionaria. Hay un límite práctico de aumento del factor de capacidad, porque los tiempos de retención se hacen demasiado grandes y los picos demasiado anchos. En la tabla 23.2 se resumen importantes ecuaciones en cromatografía.

 

Ver Tabla 23.2 • Resumen de ecuaciones cromatográficas

 

Ejemplo 23.7

Platos necesarios para una resolución dada               

Dos solutos tienen una retención relativa α = 1,08 y tienen los factores de capacidad k’1 = 5,0 y 2 = 5,4. El número de platos teóricos es prácticamente el mismo para ambos compuestos. ¿Cuántos platos se necesitan para tener una resolución de 1,5? ¿Y para una resolución de 3,0? Si . la altura de plato es 0,20 mm, ¿qué longitud debe tener la columna para una resolución de 1,5?

SOLUCIÓN Usando la ecuación 23.30 resulta:

Para duplicar la resolución a 3,0 se requerirían a veces más de platos = 3.46 x 104 platos. Para una resolución de 1,5. la longitud de columna que se necesitaría sería (0.20 mm/plato)(8,65 x 103 platos) = 1,73 m.

23.5 ¿POR QUÉ SE ENSANCHAN LAS BANDAS?6

La banda de un soluto se ensancha inexorablemente a medida que recorre una columna cromatográfica (figura 23.11), y llega al detector con una desviación estándar σ . Cada uno de los mecanismos individuales que contribuyen al ensanchamiento produce una desviación estándar σi. La varianza observada es la suma de las varianzas de todos los mecanismos.

La varianza es aditiva, pero no la

desviación estándar.

Ensanchamiento fuera de la columna

Los solutos no se pueden aplicar a la columna en forma de una zona infinitamente fina, de modo que la banda tiene una anchura finita incluso antes de entrar en la columna. Si la banda se aplica como un segmento de anchura t(medida en unidades de tiempo), su contribución a la varianza de la anchura de banda final es

Una relación igual es válida para el ensanchamiento en el detector, que exige un tiempo t para que la muestra pase a través de él. A veces es posible hacer la detección en la misma columna, y entonces se elimina el ensanchamiento de banda debido por el detector.

Ejemplo 23.8

Ensanchamiento de banda antes y después de la columna

Una banda que sale de una columna a un caudal de 1,35 ml/min tiene una anchura a mitad de altura de 16,3 segundos. La muestra se aplicó en forma de un pequeño segmento de un volumen de 0,30 ml, y el volumen del detector es 0,20 ml. Hallar las varianzas introducidas en la inyec­ción y en la detección. ¿Cuál seria la anchura la mitad de altura si el ensanchamiento ocurriese sólo en la columna?

SOLUCIÓN La figura 23.9 nos dice que la anchura a mitad de altura vale w1/2 = 2.35 σ por término medio. Por tanto, la varianza total observada es

El peor ensanchamiento de banda que se puede dar se origina por el gran espacio muerto que tienen las columnas preparadas en el propio laboratorio, donde cada nueva gota que sale de la columna se mezcla con un volumen significativo de eluato que ya existe en el espacio muerto de la columna. Para minimizar el ensanchamiento de banda, se deben minimizar los espacios muertos y la longitud de tubos. Las muestras se deben aplicar uniformemente en forma de una zona estrecha, y hacerlos entrar en la columna antes de mezclar con el eluyente.

Ecuación de altura de plato

La altura de plato (H) es proporcional a la varianza de la banda cromatográfica (ecuación 23.27): Cuanto menor es la altura de plato, más estrecha es la banda. La ecuación de van Deemter nos dice cómo influye la columna y el caudal en la altura de plato.

donde ux es la velocidad lineal de flujo y A, B y C son constantes para una columna y una fase estacionaria dadas. Al cambiar la columna y la fase estacionaria, cambian los valores

de A, B y C. La ecuación de van Deemter nos dice que existen mecanismos de ensanchamiento de banda que son proporcionales a la velocidad de flujo, otros inversamente pro­porcionales a la velocidad de flujo, y finalmente otros independientes de la velocidad (figura 23.14).

En las columnas empaquetadas, todos estos términos contribuyen al ensanchamiento de banda. En columnas tubulares abiertas, el término de camino múltiple (A) es 0, de manera que el ancho de banda disminuye y la resolución aumenta. En electroforesis capilar (capítulo 26), tanto A como C valen 0, reduciéndose así la altura de plato a valores por debajo de una micra y permitiendo separaciones extraordinarias.

Columnas empaquetadas: A, B, C O

Columnas tubulares abiertas: A = O,

Electroforesis capilar: A = C = O

Difusión longitudinal

Si se aplicase una banda fina de soluto, en forma de un disco, en el centro de la columna, la banda se ensancharía lentamente desde la región de mayor concentración dentro dé la banda hacia regiones de menor concentración en los bordes de la misma. Este ensanchamiento difusional de una banda llamado difusión longitudinal, porque la difusión tiene lugar a lo largo del eje de la columna, ocurre mientras toda la banda pasa a lo largo de la columna por el flujo del disolvente (figura 23.15).

El término Blux de la ecuación 23.33 se debe a la difusión longitudinal. Cuanto más rápido es el flujo lineal, menos tiempo se pasa en la columna, y menos ensanchamiento difusional se produce. La ecuación 23.26 nos dijo que la varianza debida a la difusión es

donde Dm es el coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil, t es el tiempo y HD es la altura de plato debida a la difusión longitudinal. El tiempo necesario para recorrer la longitud de la columna es Llux, donde L es la longitud de la columna y ux es la velocidad lineal de flujo.

Dado que la difusión longitudinal en un gas es mucho más rápida que la difusión en un líquido, la velocidad de flujo óptimo en cromatografía de gases es mayor que en cromatografía de líquidos.

Existe otro término de transferencia de masa debido a la velocidad finita de difusión del soluto a través de la fase móvil. La difusión a través tanto de la fase móvil como de la estacionaria podría limitar la velocidad de transferencía de masa en diferentes tipos de cromatografía en diferentes condiciones. Por simplicidad, utilizamos un sólo término en la ecuación 23.35.

Tiempo finito de equilibro entre las fases

El término Cux de la ecuación 23.33 se debe al tiempo finito que necesita el soluto para alcanzar el equilibro entre las fases móvil y estacionaria. Aunque algo de soluto se queda en la fase estacionaria, el resto, que se encuentra en la fase móvil, avanza, y de ahí resulta un ensanchamiento de toda la zona (figura 23.16).

La altura de plato debida al tiempo finito de equilibrio, también llamado el término de transferencia de masa, es

donde k' es el factor de capacidad, d es el espesor de la fase estacionaria y DS es el coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria.

La altura de plato debida a transferencia de masa se reduce disminuyendo el grosor de la fase estacionaria, con lo que disminuye el tiempo necesario para que el soluto se difunda hacia dentro y hacia fuera. La altura de plato debida a la transferencia de masa disminuye también aumentando la temperatura, porque aumenta el coeficiente de difusión

del soluto en la fase estacionaria. En la figura 23.17, un aumento de temperatura permite que la velocidad lineal de flujo aumente en un factor de 4 mientras se mantiene constante la resolución. Esto es posible porque a temperatura elevada aumenta la velocidad de transferencia de masa entre las fases.

Disminuyendo el grosor de la fase estacionaria se reduce la altura de plato porque el soluto puede difundirse con mayor rapidez desde las partes más profundas de la fase estacionaria hasta la fase móvil.

Antes, al término A se le solía llamar el término de la difusión turbulenta (eddy difusion term).

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