Capítulo 25

CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDOS

DE ALTA EFICACIA

La cromatografía de líquidos es importante porque la mayoría de los compuestos no son suficientemente volátiles para que se les pueda aplicar la cromatografía de gases. La cromatografía moderna se desarrolló a partir del experimento que se representa en la figura 23.5, consistente en aplicar un analito y un eluyente por el extremo de una columna abierta, alimentada por gravedad y que contiene una fase estacionaria. Esta técnica se usa ampliamente en química preparativa y en bioquímica, para aislar cantidades del orden de miligramos a gramos de una sustancia. Las columnas abiertas se usan en química analítica para purificar y concentrar muestras, por extracción en fase sólida (apartado 28.3).

La cromatografía de capa fina es una

forma de cromatografía de líquidos

que se usa sobre todo en análisis

cualitativo. Se muestra en la lámina

en color 22.

 

  La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presión elevada para forzar el paso del disolvente por una columna que contiene partículas muy finas, consiguiendo así separaciones de gran resolución. El sistema HPLC que se muestra en la figura 25.1 consta de un sistema de suministro de disolvente, una válvula de inyección de muestra, una columna de alta presión, un detector y un ordenador para controlar el sistema y visualizar los resultados. Actualmente muchos sistemas incluyen además un horno para controlar la temperatura de la columna. En  este  capítulo  se  describen  estos componentes,  y  los  factores  que  rigen  la  calidad de  las  separaciones cromatográficas. De momento, nos limitamos a la cromatografía de reparto líquido‑líquido y de adsorción líquido‑sólido.

25.1 EL PROCESO CROMATOGRÁFICO

En el capítulo anterior vimos que para aumentar la eficacia en cromatografía de gases debemos aumentar la velocidad de transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase móvil. En columnas tubulares abiertas, esto se consigue disminuyendo el espesor de la fase estacionaria y reduciendo el diámetro de la columna, de modo que las moléculas se puedan  difundir rápidamente de la fase líquida a la fase estacionaria que recubre la pared. La difu­sión en líquidos es 100 veces más lenta que en gases. Por tanto, en cromatografía de líquidos, por lo general, no es factible usar columnas tubulares abiertas, porque el diámetro de la vena líquida del disolvente es demasiado grande para que lo atraviese una molécula de soluto en poco tiempo. La cromatografía de líquidos se hace con columnas empaquetadas.

Las partículas pequeñas aseguran mayor eficacia pero requieren mayor presión

La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria. El tamaño típico de las partículas en HPLC es de 3‑10 , m. La figura 25.2 ilustra el aumento de resolución que se consigue al disminuir el tamaño de

Figura 25.2 Cromatogramas de una misma muestra obtenidos con una columna empaquetada de particulas de sícile,

partícula al pasar de 10 a 5 , m. Se puede ver cómo se hacen más estrechos los picos, y cómo se resuelve un pico nuevo de los componentes que se eluyen más lentamente. La figura 25.2 muestra que al disminuir el tamaño de las partículas se reduce la altura de plato, incluso a caudales altos.1 En condiciones óptimas (cerca del mínimo en la figura 25.3), el número de platos teóricos de una columna de longitud L (cm) es2

donde dp es el diámetro de las partículas en micrómetros. Una columna de 15 cm de lon­gitud y partículas de 5 m de diámetro pueden tener 104 platos, aproximadamente. Cuanto más pequeñas son las partículas, mayor es el número de platos.

Una razón de por qué las partículas pequeñas originan mejor resolución es que permi­ten un flujo más uniforme a través de la columna, reduciendo así el término de camino múltiple (A) de la ecuación de van Deemter (23.33). Otra razón es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusión en la fase móvil que hay entre las partículas es del orden del tamaño de las partículas. Cuanto más pequeñas son las partículas, menor es la distan­cia en la que debe difundirse el soluto en la fase móvil. Este efecto disminuye el término C de la ecuación‑de van Deemter, correspondiente al tiempo finito de difusión.

La desventaja que tienen las partículas pequeñas es la resistencia que ofrecen al flujo del disolvente. La cromatografía analítica de alta eficacia precisa presiones de ~ 7‑40 MPa (70‑400 atm) para alcanzar caudales de ~0,5‑5 m1/min.

La columna

El equipo HPLC de la figura 25.1 utiliza columnas de acero o de plástico de una longitud de 5‑30 cm y un diámetro interior de 1‑5 mm (figura 25.4). Las columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo o las partículas de las muestras o del disolvente. Por eso, se protege la entrada de la columna con una columna corta, la precolumna, que con­tiene la misma fase estacionaria que la columna analítica. Las partículas finas y solutos que se adsorben con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que reemplazar periódicamente.

La ecuación 25.1 se aplica a una

columna que opera en el mínimo de

la curva de van Deemter (como la de

la figura 25.3). Cuanto menor es el

tamaño de partícula, más eficaz es la

columna. Con partículas pequeñas

hay que usar altas presiones para

obtener un caudal razonable.

 

Calentando una columna cromatográfica, de ordinario, disminuye la viscosidad del disolvente, reduciéndose así la presión requerida o permitiendo un mayor caudal. Al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retención (figura 23.17) y mejora la resolución, porque aumenta la velocidad de difusión de los solutos. Sin embargo, aumen­tando la temperatura se puede degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna. Si no se controla, la temperatura de la columna fluctúa con la temperatura ambiente. Usando un horno a un temperatura a unos pocos grados por encima de la tem­peratura ambiente se mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención y la precisión del análisis cuantitativo.

La fase estacionaria

El soporte más común en HPLC son partículas microporosas esféricas de sílice muy pura, que son permeables al disolvente, y que tienen un área superficial de varios centenares de metros cuadrados por gramo (figura 25‑5). La sílice se disuelve en agua a pH superior a 8, por lo que no puede utilizarse por encima de ese pH. Algunas calidades de sílice son esta­bles hasta pH 9 ó 10. Para cromatografiar compuestos básicos a pH entre 8 y 12, se pue­den usar soportes poliméricos, como el poliestireno (figura 26‑1).3

La superficie de la sílice (figura 25.6) tiene hasta 8 , ** figura **moles de grupos silanol (Si‑OH) por metro cuadrado. Todos los grupos silanol están prácticamente protonados si el pH es ~2‑3. Se disocian formando Si‑O en un amplio intervalo de pH por encima de 3. Los grupos Si‑O superficiales retienen con fuerza las bases protonadas ** figura ** y ori­ginan colas (figura 25.7).

La sílice pura se puede utilizar como fase estacionaria en cromatografía de adsorción. Más frecuente es la cromatografía de reparto líquido‑líquido, que se lleva a cabo con fase estacionaria enlazada covalentemente a la sílice, mediante reacciones semejantes a ésta

Fases polares comunes

 

Fases no polares comunes

 

R = (CH2)3NH3

Amino

R = (CH2) 17CH3

Octadecilo

R = (CH2)3C = N

Ciano

R = (CH2)7CH3

Octilo

R = (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH

Diol

R = (CH2)3C6H5

Fenilo

 

La fase estacionaria de octadecilo

(C18) es con mucho la más usada en

HPLC. Se la designa frecuentemente

como ODS, abreviatura de octade-

cilsilano. El recuadro 25.1 describe

algunas fases enlazadas con funcio-

nes especiales.

Aproximadamente, hay ~4 , moles de grupos R por metro cuadrado de soporte, perdiéndose muy poca fase estacionaria de la columna durante una cromatografía.

El enlace siloxano (Si‑O‑SiR) se hidroliza por debajo de pH 2, de modo que la HPLC con una fase enlazada en soporte de sílice está limitada al intervalo de pH 2‑8. Si los áto­mos de silicio se enlazan con grupos voluminosos isobutilo (figura 25.8), el enlace Si‑O­- Si se hace menos accesible al ataque de H30+ y la fase estacionaria es estable a pH bajos durante largos periodos, incluso a temperaturas elevadas (p. ej. a pH 0,9 a 90 °C).

RECUADRO ° 25.1  Cómo diseñar fases estacionarias

Fase estacionaria diseñada para separar fullerenos: (a) estructura molecular, (b) dibujo en el espacio. [Tomado de J. Xiao, M. R. Savina, G. B. Martín, A. H. Francis y M. E. Meyerhoff, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 9341.]

Se pueden emplear fases estacionarias especiales para cromatografía cuando las fases ordinarias no pueden separar los componentes de una mezcla. Por ejemplo, la separación de isómeros ópticos es importante en la industria farmacéutica, cuando los dos enantiómeros de un medicamento tienen una actividad biológica o una toxicidad distinta. Para separar isómeros ópticos, existen en el mercado numerosas fases estacionarias enlazadas de quiral (ópticamente activas) .4 El recuadro 24.1 trata de las ciclodextri­nas, usadas como fase estacionaria en cromatografía de gases y de líquidos.

Las mezclas de fullerenos (compuestos completamente cerra­dos de carbono, como el C60 que representa en la figura 18.21) son difíciles de separar, porque las moléculas son muy semejan­tes. Una fase estacionaria con grupos de tetraporfirina presenta concavidades de tipo aromático, poco profundas, en el que se acoplan los fullerenos, por interacción entre los electrones pi de la porfirina y los electrones pi del fullereno.

El cromatograma muestra la separación preparativa de fullere­nos por HPLC. Los picos son anchos porque se inyectó un muestra grande, para aislar la mayor cantidad posible. Esta columna podría separar C82  de La @ C82. La molecula  La@C82 contiene La3+ en el interior de una jaula .

Cromatograma de una mezcla de fullerenos obtenido en una columna de 4,6 mm x 25 cm, eluyendo con una mezcla de un 25 % v de CS2 y 75 % v de tolueno a un caudal de 1 ml/min. El volumen inyectado fue 150 l. [Tomado de J. Xiao, M. R. Savina, G. B. Martín, A. H. Francis y M. E. Meyerhoff, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 9341.]

El proceso de elución

En cromatografía de adsorción el disolvente compite con las moléculas del soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria (figura 25.9). La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto del adsorbente es prácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplaza­miento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.

La serie eluotrópica es la ordenación de los disolventes de acuerdo con su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente. La fuerza eluyente es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor cero para el sis­tema pentano/sílice pura. La tabla 25.1 ordena una serie de disolventes de acuerdo con su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna.

Cromatografía de fase normal:

• fase estacionaria polar

• cuanto más polar es el disolvente,

 

más fuerza eluyente tiene.

Cromatografía de fase inversa:

• fase estacionaria no polar

• cuanto menos polar es el disol-

 

vente, más fuerza eluyente tiene.

Elución isocrática : un disolvente

Elución gradiente: cambio continuo

de la composición del eluyente en

sentido de aumento de fuerza elu-

yente. La elución gradiente en HPI_C

es semejante a la programación de

temperatura en cromatografía de

gases. Para eluir solutos fuertemente

retenidos hay que aumentar la fuerza

eluyente del disolvente.

 

La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionara polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de fase inversa elimina las colas de los picos, porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningún soluto originando colas (figura 23.19). La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impu­rezas polares (como el agua) que pueda haber en el eluyente.

Elución isocrática y gradiente

La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolven­tes fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los com­ponentes, se puede usar una elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo así un gradiente continuo.

Tabla 25.1 • Serie eluotrópica y longitudes de onda de corte en el ultravioleta de los disolventes, en cromatografía de adsorción sobre sílice

Disolvente

Fuerza eluyente

Corte en el ultravioleta (nm)

Pentano

0,00

190

Hexano

0,01

195

Heptano

0,01

200

Triclorotrifluoroetano

0,02

231

Tolueno

0,22

284

Cloroformo

0,26

245

Diclorometano

0,3

233

Éter dietíico

0,43

215

Acetato de etilo

0,48

256

Éter metil t-butílico

0,48

210

Dioxano

0,51

215

Acetonitrilo

0,52

190

Acetona

0,53

330

Tetrahidrofurano

0,53

212

2-Propanol

0,60

205

Metanol

0,70

205

 

El corte en el ultravioleta del agua es 190 nm.

FUENTES: L. R. Snyder en High‑Performance Liquid Chromatography (C. Horváth, ed.), Vol. 3 (New York: Academic Press, 1983); Burdick & Jackson Solvent Guide, 3a ed. (Muskegon, MI: Burdick & Jackson Labora­tories, 1990.)

La figura 25.10 muestra el efecto de aumentar la fuerza eluyente en la elución isocrá­tica de ocho componentes en una columna de fase inversa. En una separación con fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace más polar. El primer cromatograma (superior izquierda) se obtuvo con disolvente que tenía un 90% de acetonitrilo y un 10% de tampón acuoso. El acetonitrilo tiene una gran fuerza eluyente, y eluye todos los compuestos rápidamente. De hecho, sólo se observan cuatro picos, porque los restantes están solapados. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgánico. El primer cromatograma se obtuvo con un 90% de B. Cuando se redujo la fuerza eluyente utilizando un disolvente con 80% de B, se consigue una separación algo mejor, observándose cinco picos. Con un 60% de B, se empiezan a ver seis picos. Con un 40% de B, se ven claramente ocho picos, pero los picos 2 y 3 no están com­pletamente resueltos. Con un 30% de B, todos los picos quedan bien resueltos, pero la separación deja que desear porque tarda demasiado. Ajustando a 35% el contenido de B (el gráfico de abajo), se separan todos los picos en poco más de 2 horas (que todavía es demasiado tiempo para muchos fines).

El recuadro 25.2 describe la elución

gradiente en cromatografía de flui-

dos supercríticos.

A partir de los datos obtenidos con las eluciones isocráticas en la figura 25.10, se eli­gió el gradiente que se representa en la figura 25.11, con el que se consiguió resolver todos los picos en 38 min. Primero, se trabajó con un 30% de B (B = acetonitrilo) durante 8 minutos, para separar los componentes 1, 2 y 3. A continuación se fue aumentando de forma continua la fuerza eluyente durante 5 minutos hasta alcanzar un 45% de B, y se mantuvo durante 15 minutos, para eluir los picos 4 y 5. Finalmente, se modificó el disol­vente hasta alcanzar un 80% de B en 2 minutos, manteniéndose esa composición para eluir los últimos picos.

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