APENDICE 2. PREPARACION DE REACTIVOS

2.1. Reglas generales de solubilidad

2.1.1. Son solubles en agua:
sales de sodio, potasio y amonio;
sulfatos, (excepto los de  plomo y bario) muy poco los de calcio, estroncio y plata;
cloratos, nitratos y acetatos;
cloruros (excepto los de plata y mercurio), levemente el de plomo.

2.1.2.Son insolubles en agua:
fosfatos, carbonatos, óxidos, sulfuros, sulfitos y silicatos a excepción de los de sodio, potasio y amonio;
los hidróxidos con excepción de los de sodio, amonio y potasio, levemente los de calcio, bario y estroncio.

2.2. Normas generales para preparar soluciones

2.2.1.Porcentaje por peso: Se expresa así la cantidad en gramos de una sustancia contenida en 100 mi de solución. Para soluciones diluidas (hasta 10%) se agregan los 100 ml a la cantidad pesada en gramos del compuesto; cuando la concentración que se necesita es mayor conviene depositar los gramos del compuesto en un matraz graduado y completar a 100 ml de solución con agua para evitar un error grande.

2.2.2. Solución molar (M): Es la que contiene una molécula-gramo de la sustancia disuelta por litro de solución (no de solvente); por lo tanto, debe tomarse el peso formular  o peso molecular, expresado en gramos, del compuesto, disolverlo en un matraz aforado y completar luego a un litro con agua.

2.2.3. Solución molal (m): Es aquella que contiene una molécula-gramo de un soluto determinado en 1000 g de un solvente; por lo tanto se agrega el litro completo de agua al total de gramos pesados del soluto.

2.2.4. Solución normal (N): Contiene un peso-equivalente, expresado en gramos, de una terminada sustancia en un litro de solución. Peso equivalente es la cantidad de la sustancia que equivale a un átomo-gramo de hidrógeno, es decir el número de iones que se combinaron con H+ o OH-, por lo tanto hay que conocer la fórmula del compuesto a disolver.

2.2.5 ppm: Corresponde a la designación de partes por millón, refiriéndose a las partes, por peso, de una sustancia dada medida en mg de ella en un litro de solución (puesto que un litro de agua pesa 1 millón de mg).

2.3. Regla simple para dilución de soluciones

Para facilitar la dilución de soluciones molares o en porcentaje, se recomienda observar la siguiente regla:

De la solución más concentrada se toma un volumen que sea numéricamente igual o múltiplo de la concentración que se desea obtener y se agrega agua en cantidad suficiente para completar hasta el volumen que sea numéricamente igual o múltiplo de la concentración que se tenía. Por ejemplo: para preparar una solución 0.28 M (o 280) a partir de una solución 0.50 M (o 50%) se toma 28 ml de esa última, (6 14, 6 56 ml, etc.) y se agrega agua hasta completar 50 ml (6 25, 100, y así sucesivamente).

Esta misma regla se aplica para productos en polvo, como abonos, pesticidas, y otros, cuando se les desea diluir como tales, u otro producto inerte, haciéndose las mediciones por pesada.

2.4. Solución tampón

Puesto que por simple mezcla directa nunca se obtiene el pH exacto deseado, es recomendable controlar el pH de la solución resultante mediante un potenciómetro. Si éste no corresponde al deseado agregue gotas de hidróxido o ácido hasta obtenerlo.

2.4.1. Solución tampón de fosfato 0. 066 M (pH 6.5)

Prepare dos soluciones madres en forma separada; pese 9.47 g de Na2HPO4 anhidro y disuélvalos en un litro de agua destilada; luego pese 9.08 g de K2HPO4 anhidro y disuélvalos también en un litro de agua destilada.

Para el tampón final deseado mezcle 60.5 ml de la solución de Na2HPO4 con 135 ml de la solución de K2HPO4. Diluya la mezcla, completando a un litro con agua destilada.

Este tampón se usa para el experimento de la Reacción de Hill en cloroplastos aislados.

2.4.2.Solución tampón de citrato-fosfato (pH 6.8)

Preparar dos soluciones madres en forma separada:

Sol. 1:0.1 M ácido cítrico (monohidratado), pesar 21.014 g del compuesto y disolverlo en un litro de agua destilada.

Sol. 2:0.2 M fosfato sódico (dibásico), pesar 53.614 g del compuesto heptahidratado y diluirlos a un litro con agua destilada.

Para el tampón final combinar 182 ml de 0.1 M de ácido cítrico (sol. 1) con 618 mi de la solución de fosfato sódico (sol. 2). Completar la mezcla a un litro con agua destilada. Este tampón se usa para preparar la solución de bicarbonato de Na.

2.4.3. Solución tampón de fosfato 1M (varios pH)

Para preparar un litro de las soluciones madres pese: 178.01 g de Na2HPO4, y 192.12 g de ácido cítrico. Para el tampón final mezcle las dos soluciones, según indica el Cuadro No. 97 y complete, cada vez que sea necesario, a un litro con agua destilada.

Este tampón se usa para apertura estomática.

CUADRO No. 97. Solución tampón de fosfato.

pH

Na2 HPO4 x 2 H2 O(1 M)

Acido cítrico (1 M)

4.5

 441 ml

559 ml

5.0

 515 ml

485 ml

5.5

 580 ml

420 ml

6.0

    631.5 ml

   368.5 ml

6.5

   692.5 ml

   307.5 ml

7.0

   823.5 ml

   176.5 ml

 

2.5. Colorantes e indicadores

2.5.1. Solución de aceto-orceina:

Caliente 45 ml de ácido acético y disuelva 2 g de orceina. Deje enfriar y agregue 55 ml de agua destilada.

2.5.2.        Solución de azul de bromotimol:

Disolver 0.1 g de azul de bromotimol en 100 ml de agua, agregar a esto trazas de hidróxido de amonio (1 gota por litro) para virar la solución a color azul intenso. Para el test de fotosíntesis diluir 0.1% de la solución madre en el agua donde se colocará la elodea.

2.5.3.Solución de azul de metileno:

Para su uso como colorante vital frecuentemente se emplea en diluciones de una parte de colorante con 10 000 o más partes de alcohol etílico 95%. El colorante es absorbido por el núcleo y los organoides del citoplasma.

Para teñir bacterios prepare una solución madre disolviendo 1.48 g del colorante en 100 ml de etanol 95%. Diluir antes de usar, mezclando 10 ml de la solución madre con 90 ml de agua destilada. Sirve para teñir el frotis de bacterios.

2.5.4. Solución de difenil-amina

Disolver 0.5 g de difenil-amina en 100 ml de ácido sulfúrico concentrado. Se utiliza para el reconocimiento de nitratos, con los cuales da un color azul al aplicar unas gotas al tejido.

2.5.5. Solución 2.6-diclorofenol-indofenol

Disolver 104 mg de la sal sódica del indicador y 84 mg de bicarbonato de sodio en 200 ml de agua destilada, filtrar si fuera necesario y guardar en refrigerador.

2.5.6. Solución de fenolftaleína

Se prepara disolviendo 0.5 g de fenolftaleína en 100 ml de alcohol 95%. Para pruebas muy sensibles se usa una solución al 0.1%.

2.5.7. Solución de fucsina ácida

Para una solución al 0.5% pesar 500 mg y disolverlos en 100 ml de agua, agregar luego 5 ml de alcohol metílico para ayudar en su preservación, ya que se trata de una solución madre. Se usa también al 1%.

2.5.8. Solución de rojo-fenol:

Es un indicador alternativo con el azul de bromotimol. Moler 0.05 g del compuesto con 14.1 ml de NaOH 0.01 N en un mortero, agregar agua destilada hasta completar 125 ml de solución del indicador.

2.5.9. Solución de rojo neutro:

Para su uso como indicador se emplea comúnmente una solución al 1%, esto es 1 g de rojo neutro se disuelve en 100 ml de alcohol 50/0. Su rango de variación de pH va de 6.8 rojo al 8.0 amarillo. Para teñir células vivas se usa 1:3000 alcohol absoluto.

2.5.10. Solución de safranina:

Pese 1 g de safranina y disuelva en 10 ml de alcohol 50%, agregue 85 ml de agua destilada. En el momento de usar diluya una parte de la solución en 9 partes de agua.

2.5.11. Solución de sudan IV.

Pese 1 g de Sudán IV, disuelva en 100 ml de etanol 95% calentándolo hasta el punto de ebullición, enfriar y decantar. Después agregue 40 ml de glicerina a 60 ml de la solución saturada. Para teñir, corte secciones delgadas del material sobre un portaobjetos, agregue el colorante de modo que flote en él y cúbralo, caliente suavemente. Después de 10 a 20 minutos observe al microscopio los glóbulos de grasa que aparecen rojos (como el color del colorante), claros y brillantes.

2.6. Fijadores

2.6.1. Solución de formalina al 5%

La formalina es una solución acuosa al 40% del gas formaldehido; para preparar la solución deseada agregar 5 ml de esta formalina a 95 ml de agua destilada y agitar.

2.6.2. FAA

Es uno de los fijadores más usados en tejido vegetal, mata y fija los tejidos en forma estable y con buena acción endurecedora, muy útil.

Mezclar 50 ml de alcohol etílico 95% con 5 ml de ácido acético glacial, agregar 10 ml de formaldehido (formo) comercial 37 a 40%) y completar con agua destilada (35 ml). Esta mezcla puede durar varios años. Se puede encontrar varias modificaciones en la literatura,

según las necesidades: deshidratación más lenta (menos alcohol y formalina); hinchazón del protoplasma (más ácido acético), etc.

2.7. Reguladores

Es una práctica común en laboratorio preparar soluciones de elevadas concentración a las que se les denomina soluciones madres. A partir de éstas y mediante diluciones, se procede a preparar las concentraciones que se desean.

Si se usan las soluciones de reguladores para pulverizar, es recomendable agregarles un surfactante (Tween 20 o Teepol) al 0.05%.

2.7.1.Solución de ácido giberélico

El ácido giberélico se disuelve en 2 a 3 ml de alcohol etílico absoluto. Luego diluya la solución con agua destilada tibia hasta alcanzar el litro o la cantidad necesaria. Su peso molecular es 346.4 g.

2.7.2. Solución de Alar (B-995, ácido succinico 2.2-dimetilhidrazida).

El peso molecular es 160, por lo tanto sise necesita 1 litro de una solución 10-2 M se pesan 1.6 g y se disuelven en agua destilada.ilamonio cloruro1-piperidina oxilato).

El peso molecular es de 358. Para una solución acuosa de 10-2 M se pesan 3.58 g y se disuelven en un litro de agua destilada.

2.7.4. Soluciones de Auxinas

Para preparar una solución de AIA 100 ppm disuelva 100 mg de AIA en 2 a 5 ml de alcohol absoluto y lentamente, sin dejar de agitar, agregue agua destilada tibia hasta completar unos 950 ml. Luego, una vez fría la solución, afore a 1 litro. El peso molecular de AIA es de 175.19 g y del Al B es de 203.24 g.

La solución una vez preparada dura aproximadamente 2 semanas. Se debe guardar en refrigerador y frasco oscuro.

2.7.5. Solución de citocininas

Son de difícil solubilización en agua, por esto se disuelven en 1 a 2 ml de HCI 0.1 N (o bien en 1 a 2 ml de KOH 0.3 N). Una vez disuelto el compuesto se le agrega lentamente agua a 33°C hasta completar el litro. El pH debe ajustarse a 5. El peso molecular de la cinetina es de 215.2 g y de la bencilaminopurina es de 225.2 g.

2.7.6. Solución de CCC (C-y-cocel, 2-cloroetil-cloruro trimetil-amonio).

Su peso molecular es 158. Para un litro de solución de 10-2 M pese 1.58 g y disuelva en agua destilada.

2.7.7. Solución de 2.4-D (Acido 2.4-diclorofenox¡acético).

El 2.4-D, al igual que las soluciones de auxinas, se debedisolver en alcohol absoluto(o en NaOH al 0.1%), luego diluir con agua destilada. Su peso molecular es de 221.

2.7.8. Solución hidracida maleica (HM)

Su peso molecular es 112. Se disuelve en agua destilada a 50°C aproximadamente y se agita continuamente por 1 a 2 horas.

2.8. Solución de bicarbonato de sodio (10-2 M) en tampón de citrato-fosfato.

Se utiliza el tampón de citrato-fosfato preparado como ya se indicó. Disolver 0.420 g de NaHCO3 en tampón de citrato-fosfato pH 6.8 y ajustar el volumen final a 500 ml con el tampón.

2.9. Solución de Fehling

Las soluciones 1 y 2 se preparan y se guardan separadamente en botellas con tapones de goma. Para detectar azúcares simples agregar cantidades iguales de cada solución a un tubo de ensayo con la sustancia a probar y calentarlo, si la prueba es positivá se formará un precipitado amarillo fuerte o rojizo.

Solución 1:  CUSO4 .5H2 O  34.65 g
agua destilada  500 ml
Solución 2:  KOH  125g
tartrato de Na y K  173 g
 agua destilada  500 ml

2.10. Solución de guayacol al 3%

Para preparar 100 ml de solución, pesar 3 g (si está sobre su punto de fusión serán 3 ml) y disolverlos primero con suficiente alcohol etílico de 95° y luego, agitando en un plato eléctrico a unos 30°C, agregar agua destilada tibia hasta completar los 100 ml. Usar de inmediato.

2.11. Solución indicadora de concentración de CO2

Para obtener 1 litro de solución pesar 84 mg de NaHCO3, 7.46 g de KCI y 10 mg de rojo de cresol. Disolver cada producto en 100 ml de aguó, luego mezclar y completar a 1 litro con agua destilada. Esta solución queda con un pH de 6.8 pero es conveniente dejar  abierto el frasco que lo contiene para que se equilibre con la atmósfera del lugar. El color de esta solución indicadora recién preparada es rojo suave, en medio ácido vira a amarillo y en medio básico adquiere un color rojo; ,sirve de indicadora del tenor de CO2 del aire: al aumentar éste, aumenta la acidez del medio y al disminuir se vuelve alcalina.

2.12. Solución de Lugol

Se usa para comprobar presencia de almidón en tejidos. Para prepararla disuelva 10 g de yoduro de potasio en 10 ml de agua destilada, enseguida agregue 5 g de.yodo, haga una pasta y luego diluya a 100 mi con agua destilada.

Para las pruebas usar una dilución al 10% del reactivo madre combinando 1 mi de éste con 9 ml de agua destilada. La solución madre puede durar sin problemas más de un año, teniendo la precaución de guardarla en frasco oscuro y en refrigerador.

2.13. Solución de manitol

El manitol es un azúcar que se absorbe con dificultad por las plantas, por esta razón se usa para dar un potencial de agua definido.

Para calcular la cantidad de manitol necesaria paró preparar la solución deseada se usa  la fórmula:

CUADRO No. 98. Gramos de manitol por litro de agua a 25°C necesarios para obtener un  potencial de -3 y -6 bares.

soluto (bares)

g manitol/1 agua

-6

22.18

-6

44.4

 

El mismo procedimiento se sigue si se usa Carbowax (Polietilenglicol) en vez de manitol. Se recomienda usar Carbowax sólo en los casos que se necesite mucha exactitud o cuando la duración del experimento es muy larga.

2.14. Soluciones nutritivas

De las recomendadas corrientemente destaca la Hoagland modificada hoy día en su fórmula original al contener el Fe en forma de quelato. Las soluciones madres para la preparación de las diferentes fórmulas nutritivas y las cantidades que se deben tomar en cada caso están indicadas en el Cuadro No. 99. Los compuestos a usar deben ser puros, para análisis.

CUADRO No. 99. Soluciones madres.

Símbolo

Compuesto

Concentración

A

Ca (NO3)2 ° 4 H2 O

1 Molar (236      g/1)

B

KNO3

1 Molar (101      g/1)

C

MgSO4 ° 7 H2 O

1 Molar (246.50 g/1)

D

KH4 PO4

1 Molar (136      g/1)

E

Quelato de Fe*

     5 000 ppm de Fe

F

Micronutrimentos**

G

NaNO3

1 Molar (85.01   g/1)

H

MgCI2

1 Molar (95.23   g/1)

I

NaSO4

1 Molar (142.06 g/1)

J

NaH2 PO4 • H2O

1 Molar (138.01 g/1)

K

CaCI2

1 Molar (110.99 g/1)

L

KCI

1 Molar (74.55   g/1)

Al preparar las soluciones nutritivas se debe llenar los frascos con agua destilada hasta la mitad antes de colocar las soluciones madres y luego completar eÍ volumen final.

CUADRO No. 100. Tabla para la preparación de soluciones nutritivas.

Soluciones

Cantidades en ml de soluciones madres para

nutritivas

preparar un litro de solucion madre nutritiva

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

Completa

5

5

2

1

1

1

-

-

-

-

-

-

Sin N

-

-

2

1

1

1

-

-

-

-

5

5

Sin P

5

5

2

-

1

1

-

-

-

-

-

1

Sin K

5

 -

2

-

1

-

5

-

-

1

-

-

Sin Ca

-

5

2

1

1

1

5

-

-

-

-

-

Sin S

5

5

-

1

1

1

-

2

-

 -

-

-

Sin Mg

5

5

-

1

1

1

 -

 -

2

 -

-

-

Sin Fe

5

5

2

1

-

1

 -

 -

 -

 -

-

-

Sin microelementos

5

5

2

1

1

-

 -

 -

 -

 -

-

-

2.15. Solución preservadora

Disolver 1 g de timol en 100 ml de tolueno. Esta es útil para evitar infecciones fungosas en cápsulas Petri u otro o en reactivos determinados.

2.16. Solución sacarosa 0.1 M.

Disolver 4.2 g de sacarosa en agua y completar luego a 1 litro. Si no se utiliza de inmediato es conveniente agregar un preservador.

2.17. Solución de tetrazolio

Se usa en concentraciones de 1 % y 0.5% para detectar la actividad de deshidrogenasas por esto se le emplea también para determinar rápidamente la viabilidad de las semillas. La sal de tetrazolio es incolora, soluble en agua y no tóxica, al reducirse química o fotoquímicamente pasa a trifenil-formazán que es insoluble y de color rojo brillante.

Pesar 1 g (6 500 mg) de cloruro de 2,3,5-trifenil-tetrazolio y agregar 100 ml de agua destilada. La solución así preparada se guarda en frasco oscuro y refrigerador, en esas condiciones puede durar alrededor de un año.