BASES MOLECULARES DEL CONTROL BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS. EXPERIENCIA CHILENA[1]

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Bioq. Ph. D. Luz María Pérez
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad Ciencias de la Salud
Universidad Andrés Bello
lperez@unab.cl

Cita: Bases moleculares del control biológico de fitopatógenos. Experiencia chilena. Pérez, Luz María. Santiago, Chile, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Chile, 2005. :. http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_agronomicas/montealegre_j/2.html

1. Introducción

El control biológico de enfermedades de plantas constituye una práctica ampliamente difundida y sigue siendo objeto de investigación y desarrollo. Un concepto amplio de control biológico incluye nociones como las de prácticas de cultivo y resistencia a las enfermedades. Desde esta perspectiva se acepta que: “El control biológico es el control de los patógenos por uno o más organismos, logrado de forma natural o a través de la manipulación del medio ambiente, huésped o antagonistas, o por la introducción masiva de uno o más antagonistas”. Por otra parte, se encuentra el concepto clásico que se restringe a que

“Control biológico es el uso deliberado de un organismo para controlar a otro” (Control biológico). Sin embargo, y en relación a este último concepto, es necesario considerar que las interacciones de múltiples variables presentes en el medio ambiente pueden modificar las interacciones entre los microorganismos y su entorno, muchas de las cuáles pueden favorecer o impedir un control biológico efectivo (McSpadden Gardener, 2002).  .

El uso de microorganismos antagonistas de patógenos requiere de estudios previos que se inician con la selección de potenciales microorganismos controladores de fitopatógenos, para continuar con la identificación de los mecanismos que utilizan para ejercer el control biológico y posteriormente desarrollar una formulación que se pueda producir a gran escala. Los procedimientos de aplicación de los bioantagonistas también son fundamentales para lograr los efectos de control deseados.

2. Mecanismos de bioantagonismo

Los mecanismos expresados por microorganismos que pueden biocontrolar a los fitopatógenos, dependen de la naturaleza del microorganismo. Los antagonistas bacterianos utilizan principalmente la secreción de moléculas pequeñas (antibióticos) que interfieren con la formación de la pared celular de otros microorganismos (Tripathi and Gottlieb, 1969; De la Fuente et al, 2004), la secreción de sideróforos (Neilands, 1981) y la expresión de un número importante de receptores de sideróforos (Poole and McKay, 2003)  para ejercer su actividad biocontroladora.

Por otra parte, los antagonistas fúngicos pueden controlar el desarrollo de fitopatógenos a través de mecanismos semejantes a los que utilizan las bacterias, los que se pueden  complementar con mecanismos adicionales de control como el micoparasitismo, inducción de resistencia en la planta y tolerancia a estrés, competencia por nutrientes y espacio, secreción de inactivadores de los sistemas de infección del patógeno y de enzimas que hidrolizan a los componentes de las paredes celulares de los patógenos (Harman, 2004). Por lo tanto, los mecanismos de biocontrol que pueden utilizar los hongos antagonistas son más numerosos que los que utilizan las bacterias, y cada aislado puede expresar uno o más de ellos en forma simultánea frente a un determinado patógeno. De ahí que sea importante poder establecer cuántos y cuáles mecanismos está expresando un hongo antagonista frente a un determinado fitopatógeno, y si tiene la capacidad de expresar esos mismos mecanismos frente a otros patógenos (Howell, 2003), hecho que está relacionado con  la composición de la pared celular del fitopatógeno (Bartnicki-Garcia, 1968), y la inducción de la secreción de enzimas desde el biocontrolador para la degradación de esta estructura. En consecuencia, las alternativas son múltiples dado que la expresión de un determinado mecanismo de biocontrol puede tener como consecuencia desde un efecto biocontrolador específico hasta un amplio espectro de acción cuando se expresa para controlar a más de un fitopatógeno. Estos análisis permiten explicar desde el punto de vista molecular, la eficiencia y/o especificidad y/o amplio espectro de algunos antagonistas fúngicos con relación a otros (Pérez et al., 2001), y a partir de estos antecedentes seleccionar a aquel (aquellos) que sean más apropiados.

El análisis más detallado de los mecanismos de antagonismo que usan los hongos biocontroladores, en especial los relacionados con la secreción de antibióticos, permiten describir la formación de canales iónicos en la membrana plasmática de los fitopatógenos, como consecuencia de la interacción de péptidos antibióticos, los peptaiboles (Whitmore and Wallace, 2004), con dicha membrana. La formación de estos canales permite el vaciamiento celular (Chugh and Wallace, 2001). Por otra parte, la secreción de enzimas como endoquitinasas, β -1,3-glucanasas (Migheli et al., 1998) y proteasas (Elad and Kapat, 1999; De Marco and Felix, 2002), permite la degradación de los componentes de la pared celular del fitopatógeno y se considera como uno de los mecanismos importantes del control biológico (Howell, 2003). 

La inducción de resistencia en las plantas como consecuencia del tratamiento con antagonistas, es un factor que contribuye al control biológico, y que se complementa con los mecanismos que expresa un microorganismo controlador. Es así como se ha descrito la síntesis de proteínas como la zeamatina (Batalia et al., 1996), que abre canales de agua en los patógenos fúngicos; o bien, como xilanasas (Hanson et al., 2004) que hidrolizan derivados del xilano presentes en la pared celular de hongos fitopatógenos como R. solani.

3. Mecanismos de bioantagonismo- experiencia Chilena

Nuestra experiencia se centra en el uso de antagonistas para el control de patógenos que atacan el sistema radical del tomate, entre los que se encuentran Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Phytophthora Nicotianae (= P. parasitica) y Pyrenochaeta lycopersici. El control de las enfermedades producidas por lo patógenos mencionados, se ha abordado desde la perspectiva del análisis molecular de los mecanismos que expresan tanto bacterias como hongos antagonistas seleccionados para este biocontrol. Específicamente, se han seleccionado bacterias del género Bacillus para el control de R. solani  (Montealegre et al., 2003), entre los que se encuentran un aislado de B. subtilis y dos aislados de Paenibacillus lentimorbus, los que controlaron a diferentes aislados de R. solani a través de la secreción de metabolitos difusibles. Para estos aislados no se encontró participación de metabolitos volátiles, sideróforos o enzimas hidrolíticas, sugiriendo que el mecanismo de control expresado puede corresponder a la secreción de antibióticos que interfieren en la síntesis de la pared celular de R. solani. También se han seleccionado hongos del género Trichoderma, los que se han caracterizado en cuanto a su secreción de antibióticos y enzimas, y a su capacidad para incrementar el desarrollo de raíces en plantas de tomate y de inducir resistencia. Por ejemplo, para la selección de hongos antagonistas de P. lycopersici se ha realizado la caracterización isoenzimática de endoquitinasas, β-1,3-glucanasas y proteasas de diferentes aislados de Trichoderma harzianum (Figs. 1, 2, 3, 4), la que  junto al análisis de la secreción de metabolitos volátiles y difusibles ha servido para establecer cual de los aislados es el más eficiente para el control de este patógeno (Pérez et al., 2001; Pérez et al., 2002). De igual forma, se ha analizado la inducción de resistencia en plántulas de tomate por algunos de estos aislados, a través de la identificación de proteínas relacionadas con patogénesis como quitinasas y glucanasas (Gajardo et al., 2002). El análisis del conjunto de parámetros moleculares obtenidos para cada aislado bacteriano y fúngico, nos ha permitido seleccionar a algunas bacterias y hongos que pueden controlar efectivamente a los patógenos que afectan el sistema radical del tomate no solo en el laboratorio, sino que también en las condiciones en la que se cultiva el tomate a nivel de campo. De igual forma, nos ha permitido mejorar la capacidad antagónica de aislados de Trichoderma a través de la obtención de mutantes por métodos químicos, comprobada tanto a través de parámetros moleculares como de antagonismo directo con los patógenos.

En las Figuras 1 a la 4 se presentan resultados de la expresión enzimatica de los mecanismos de antagonismo de T. harzianum.

Fig 1. Actividad de endoquitinasa secretada por diferentes aislados de T. harzianum crecidos en un medio con  quitina de crustáceos (a) o paredes celulares de P. lycopersici (b) como única fuente de carbono. Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo se separaron por PAGE nativo a pH 8,8. La actividad de endoquitinasa fue visualizada después incubar el gel de poliacrilamida con un gel auxiliar de agarosa al 2% (p:v) que contenía glicol quitina, y posterior incubación con un reactivo fluorescente al 0,01% (p:v).  Las flechas indican la posición de las bandas con actividad de endoquitinasa.

Fig 2. Actividad de endoquitinasa secretada por diferentes aislados de T. harzianum crecidos en un medio con  quitina de crustáceos (a) o paredes celulares de P. lycopersici (b) como única fuente de carbono. Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo se separaron por PAGE nativo a pH 4,4. La actividad de endoquitinasa fue visualizada después incubar el gel de poliacrilamida con un gel auxiliar de agarosa al 2% (p:v) que contenía glicol quitina, y posterior incubación con un reactivo fluorescente al 0,01% (p:v).  Las flechas indican la posición de las bandas con actividad de endoquitinasa.

Fig 3. Actividad de β-1,3 glucanasa secretada por diferentes aislados de T. harzianum crecidos en un medio con  glucanos de levaduras (a) o en paredes celulares de P. lycopersici (b) como única fuente de carbono. Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo se separaron por PAGE nativo a pH 8,8 (A) y a pH 4,4 (B).  La actividad de β-1,3 glucanasa fue visualizada después incubar el gel con laminarina al 1% (p:v) y posterior tratamiento con trifeniltetrazolio al  0,15 % (p:v). Las flechas indican actividad la posición de las bandas con actividad de β-1,3 glucanasa.

Fig 4. Actividad de proteasa secretada por diferentes aislados de T. harzianum crecidos en un medio con  quitina de crustáceos (a) o con paredes celulares de P. lycopersici (b) como única fuente de carbono. Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo se separaron por PAGE nativo a pH 4,4 en un gel que contenía hemoglobina. La actividad de proteasa fue visualizado después incubar el gel y posteriormente teñir las proteínas con azul de Coomassie. Las zonas claras en el gel indican la posición de la actividad proteolitica.

4. Literatura consultada

BARTNICKI-GARCIA, S. 1968. Cell Wall Chemistry, Morphogenesis, and Taxonomy of Fungi. Annual Review of Microbiology 22: 87-108

BATALIA, M. A., MONZINGO, A. F., ERNST, S., ROBERTS, W. and  ROBERTUS, J. D. 1996 Crystal structure of the antifungal protein zeamatin, a member of the thaumatin-like, PR-5 protein family. Nat. Struct. Biol. 3: 19 – 23.

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[1] Financiado por proyectos Fondecyt 1990785 y 1040531-04, y UNAB DI 23-02.