2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS

 

Ya hemos mencionado que las enzimas, por ser proteínas, tienen pesos moleculares altos. Esto hace difícil su caracterización por métodos físicos o químicos.

2.1. Efecto de la temperatura sobre las enzimas (3,6).

Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimática, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una pérdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones enzimáticas está, con pocas excepciones, entre 30°C y 40°C, en que la actividad es máxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reacción aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10°C duplica e incluso triplica la velocidad de reacción. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera también la inactivación de la enzima por desnaturalización térmica. Para muchas enzimas la región de inactivación térmica extensiva está muy próxima de la temperatura óptima.

Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad térmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los 50°C la mayoría de las enzimas, pero no todas, se denaturan, y unas pocas muestran desnaturalización cuando se enfrían aproximadamente a 5°C. A temperaturas bajas, aunque la actividad enzimática procede muy lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se inactiven previamente las enzimas objetables, la mayoría de los alimentos congelados experimentan un considerable deterioro después de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas como -18°C algunas reacciones enzimáticas siguen teniendo lugar. Habitualmente la desnaturalización a alta temperatura es irreversible, debido a que se rompen las fuerzas débiles de enlace al aumentar la vibración térmica de los átomos componentes, fenómeno que daña la estructura tridimensional.

Es importante señalar que una misma enzima, aislada de tejidos diferentes, puede tener diferente capacidad de resistencia a la desnaturalización suave por el calor, hecho que es útil con fines de identificación o de diagnóstico.

Otras aplicaciones de la desnaturalización por el calor son la esterilización de alimentos e instrumentos y la pasteurización de la leche; ambos procesos dependen de la destrucción rápida por calor de las enzimas esenciales de los microorganismos contaminantes.

La mayoría de las enzimas son, pues, muy termolábiles y habitualmente es suficiente aplicar una temperatura de 40 a 80°C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad.

Es este hecho de inactivación completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria alimentaría. En la mayor parte de los casos de preservación de alimentos, es deseable que no haya continuación alguna de actividad enzimática.

Si ello ocurriera se podría producir, por ejemplo, un cambio en el color de la clorifila o de los carotenoides, o producirse el pardeamiento de varios alimentos; podría alterarse el sabor de los hidratos de carbono, o producirse la rancidez de las grasas. También la persistencia de actividad enzimática podría provocar cambios en el aroma o en el valor nutritivo de las proteínas (o de las vitaminas) y, finalmente, la presencia de enzimas pectinolíticas puede producir un cambio total en la textura de los alimentos.

El tratamiento con calor es, sin duda, un método adecuado para la destrucción de microorganismos que alteran los alimentos (esterilización por calor y pasteurización). De esta manera un procesamiento térmico adecuado puede lograr simultáneamente la preservación microbiológica y la estabilización de los alimentos. A veces la actividad residual de una enzima (no necesariamente objetable) se usa como prueba de la suficiencia de un proceso de tratamiento con calor.

Así, la ausencia de actividad fosfatásica de la leche es un buen indicador de si la leche ha sido pasteurizada adecuadamente, ya que esta enzima se inactiva completamente por la dosis de tratamiento térmico necesaria para destruir agentes patógenos.

Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivación térmica. Las peroxidasas vegetales son particularmente estables (120°C por unos minutos no son suficientes para destruirlas del todo). La velocidad de inactivación térmica depende también del pH, fuerza iónica y del estado físico de la enzima en el material alimentario: si la enzima está igualmente bien distribuida por todo el producto o adsorbida sobre partículas sólidas (como ocurre con las enzimas pectinolíticas y las fenolasas, las cuales están adsorbidas en la pulpa de varios jugos de frutas).

Existen situaciones en la tecnología de alimentos en las que algunas enzimas, a pesar de haber sido inactivadas, se "regeneran" y su actividad se renueva después de cierto tiempo. Este tipo de regeneración enzimática ha sido observada en los casos de peroxidasas (leche, verduras); catalasa (verduras); lipasa (productos de la leche) y enzimas pectinolíticas (jugos cítricos). La regeneración seria el resultado de una reorganización, al menos parcial, de la molécula proteica, restableciéndose las estructuras de los sitios activos que habían sido alterados por la desnaturalización.

La reversión de la desnaturalización es un proceso lento, pero durante el almacenamiento prolongado de los alimentos procesados habría tiempo suficiente para la regeneración, detectable, de algunas enzimas. De esta manera, la estabilidad de los alimentos con respecto al daño de éstos por las enzimas es una función tanto de la "profundidad" de la inactivación térmica como del tiempo y condiciones de almacenamiento.

2.2. Efecto de las radiaciones (3).

Las enzimas se afectan también por irradiación con ondas electromagnéticas. La inactivación por luz ultravioleta se debería a la fotolisis de grupos disulfuro y aromáticos de los aminoácidos que constituyen las proteínas. La inactivación de la pepsina se atribuye a la oxidación del grupo fenólico de la tirosina. Estos efectos sobre las enzimas son de escaso rendimiento, por lo que la luz ultravioleta no es de aplicación práctica, desde este punto de vista, en la tecnología alimentaría.

En cambio, la irradiación de los alimentos con radiaciones ionizantes (radiaciones beta, gamma, etc.) es de considerable importancia en el procesamiento de alimentos y ya está en uso en escala comercial. Uno de los mayores problemas en este campo es el hecho de que la destrucción de las enzimas requiere de dosis de radiación mucho más elevadas que para la destrucción de los microorganismos. En algunos casos es más práctico utilizar en forma combinada calor e irradiación para inactivar enzimas.

La actividad lipoxidásica puede reducirse al 67% de su valor inicial por irradiación a pH7 con 9x rad. Existe una pérdida adicional postradiación. Si la enzima se irradia y luego se calienta, el efecto de ambos tratamientos es sinergístico. Si la enzima se calienta primero y luego se irradia, el efecto es meramente aditivo.

2.3. Efecto de la humedad (3,4).

En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biológico, el agua es uno de los componentes más importantes.

Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas moléculas que interactúan. Además, la reactividad de muchas sustancias depende de la disociación iónica y de la configuración molecular y, por lo tanto, de la hidratación. El agua es a menudo uno de los reactantes o uno de los productos de la reacción.

Hoy se sabe que la influencia del agua sobre la reactivación del sistema no está relacionada sólo con el contenido real de agua, sino también con el estado de las moléculas de agua.

La disponibilidad de agua es una función tanto del contenido como del estado y se expresa adecuadamente por el concepto denominado "actividad del agua" () que equivale a la relación entre la presión de vapor de agua sobre el sistema (p) y la presión de vapor del agua pura (Po) a la misma temperatura:

Si los alimentos fueran simples mezclas de agua con sustancias inertes que no interactúan de ninguna manera con las moléculas de agua, la actividad del agua seria siempre 1, cualquiera sea el contenido de agua.

Los alimentos son sistemas en los cuales parte del agua está fuertemente absorbida sobre la superficie de sustancias poliméricas (proteínas, carbohidratos macromoleculares). Esto queda claramente establecido por el hecho que la presión de vapor del agua sobre un alimento con un contenido de humedad bajo o intermedio es considerablemente menor que el que predice la Ley de Raoult. Esto se conoce como "agua ligada". En estos casos; la actividad del agua es inferior al valor que le correspondería por su concentración. Una de las razones para este efecto es el hecho que el "agua libre" está parcialmente atrapada en la estructura porosa del alimento y, por lo tanto, está sujeta a la acción depresora de los capilares sobre la presión de vapor. A niveles más altos del contenido de humedad el sistema se comporta en realidad como una solución acuosa. De hecho la concentración molar de los solutos es habitualmente tan baja que la actividad del agua pronto alcanza valores cercanos a la unidad.

La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimática aumenta al aumentar el contenido de "agua libre" y ello ocurre no sólo en las reacciones hidrolíticas, en las que el agua es uno de los reactantes obvios, sino también en las reacciones no-hidrolíticas.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y concentración de los solventes.

En la práctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre la velocidad de la reacción enzimática. Incluso en los alimentos denominados desecados la acción enzimática procede a una velocidad medible.

A niveles muy bajos de humedad, la actividad enzimática puede ser afectada cualitativamente. Es el caso de la α-amilasa que a una humedad del 20 %o (o 4% de "agua libre") produce principalmente glucosa y maltosa a partir de almidón. A niveles más elevados de humedad se forman también otros oligosacáridos. Quizás lo que ocurre es que a niveles muy bajos de "agua libre", la rigidez del medio impide la difusión de la enzima o del substrato, limitándose así la hidrólisis a aquellas porciones del substrato que están en contacto inmediato con la enzima.

En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fácilmente, actividad lipolítica y proteolítica. A niveles de humedad superiores a 15% esta actividad es debida, generalmente, a las enzimas de los hongos que crecen en el cereal y que pueden participar también en las reacciones hidrolíticas, desarrollándose amargor o rancidez por la acción enzimática sobre la fracción proteolítica o lipídica durante el almacenamiento.

Los métodos modernos de liofilización de carnes y verduras han introducido problemas similares a estas industrias. La actividad enzimática se determina generalmente en estos casos por métodos autolíticos, ya que la velocidad de la reacción enzimática es baja. Por ejemplo, en el músculo de cerdo liofilizado se usa la desaparición del glicógeno muscular como un índice de actividad enzimática a diferentes niveles de humedad.

2.4. Efecto del pH y del estado iónico (3,6).

La actividad enzimática guarda también relación con el estado iónico de la molécula y, especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptídicas contienen grupos que pueden ionizarse (principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminoácidos constituyentes) en un grado que depende del pH existente. Como ocurre con las proteínas, las enzimas poseen un punto isoeléctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoeléctrico, como regla, no es igual al pH al cual se observa actividad máxima. El pH óptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en el medio ácido del estómago, tiene un pH óptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene un pH óptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayoría de las enzimas tienen un óptimo entre pH 4 y 8. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien sólo en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteración del pH es una de las razones por la que la regulación del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qué las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias.

Muchas enzimas existen en el organismo a un pH más bien alejado de su valor óptimo. Esto se debe, en parte, a la diferencia del medio ambiente "in vivo" con respecto al "in vitro". Esto recalca también que el control, del pH puede representar un importante medio para regular la actividad enzimática.

Las proteínas sufren cambios en su solubilidad, presión osmótica y viscosidad a diferentes valores de pH. Es probable que el cambio en la actividad enzimática, al variar los valores de pH, se deba a los cambios en la ionización ya sea de la enzima, del substrato o del complejo enzima-substrato.

A1 determinar la velocidad de reacción de una enzima y para cierta concentración de substrato, a diferentes valores de pH, se observa que la curva resultante tiene forma de campana. Se le denomina curva de pH: actividad. Esta curva no caracteriza, necesariamente, a una enzima, puesto que el pH óptimo puede variar para diferentes substratos, ni tampoco son similares las curvas de pH: actividad para dos enzimas que hidrolizan el mismo enlace en un substrato. Por ejemplo, las pectinometilesterasas hidrolizan específicamente los enlaces éster de polimetilgalacturonatos. La pectinometilesterasa obtenida de un hongo tiene un pH óptimo de 5,0; la de fréjoles tiene su óptima actividad a pH cercano a 8,5.

Estas diferencias sobre los pH óptimos de enzimas que actúan sobre substratos similares es de la mayor importancia en el procesamiento de alimentos. Una enzima tiene que tener buena actividad proteolítica a un pH de 4,5 a fin de ser una enzima a prueba de congelación, o a niveles de pH superiores a 5,5 para ser un buen ablandador de carne. Para la mayoría de las aplicaciones prácticas, el pH del alimento no puede ser ajustado como para adecuarlo al pH óptimo de una enzima determinada. La enzima debe escogerse en base a su actividad al pH natural del alimento. Existen algunas excepciones notables en que es factible y práctico el ajuste del pH. Para la producción de glucosa, la pasta de almidón se ajusta a un pH entre 5 y 7 para la hidrólisis óptima por la alfa-amilasa bacteriana. En cambio, el pH se ajusta entre 4 y 6 para la óptima sacarificación por la amilasa de hongos o de cereales.

La velocidad de inactivación de las enzimas varía para los diferentes valores de pH y, por lo tanto, un alza en la temperatura puede cambiar el pH óptimo. Así, en la industria de cereales el aumento de temperatura hace variar el pH óptimo de la beta-amilasa hacia valores más altos de pH. Puede aplicarse una variación intencional del pH para destruir específicamente una enzima como, por ejemplo, la inactivación diferencial de alfa-amilasa y proteasas en preparaciones enzimáticas de hongos.

Es necesario recalcar, sin embargo, que el término "pH óptimo" no tiene una significación físico-química bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reacción dada. Este rango depende no sólo de la naturaleza de la enzima particular, sino también del substrato y de la concentración de éste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensión del periodo de reacción.

2.5. Sitio activo y especificidad enzimática (5,8).

Algunas enzimas tienen una especificidad prácticamente absoluta para un determinado substrato y no atacarán ni siquiera a moléculas muy relacionadas. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la adición reversible de amoniaco. Al doble enlace del ácido fumárico, pero a ningún otro ácido no saturado.. La aspartasa también presenta una rígida estereoespecificidad y especificidad geométrica; por eso no desamina D-aspartato ni adiciona amoníaco al maleato, que es el isómero geométrico-cis del fumarato. Otro ejemplo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera, que sólo desdobla al azúcar maltosa. En el otro extremo están las enzimas que tienen una especificidad relativamente amplia y actúan sobre muchos compuestos que presentan una característica común. Por ejemplo, la fosfatasa de riñón cataliza la hidrólisis de muchos ésteres diferentes del ácido fosfórico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que pueden romper la unión entre el ácido y el alcohol en el lípido, en tanto ésta sea una unión éster (desdoblan igual etilbutirato que un triglicérido).

Del estudio de la especificidad de las enzimas por el substrato surgió la idea de que existe una relación complementaria tipo llave-cerradura entre la molécula de substrato y un área específica sobre la superficie de la molécula de la enzima, denominada el sitio activo o sitio catalítico, al cual se une la molécula del substrato, mientras experimenta la reacción catalítica.

Dos características estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) el substrato debe poseer el enlace químico específico o unión, que puede ser atacado por la enzima, y b) el substrato debe tener habitualmente algún otro grupo funcional, un grupo de unión, que se une a la enzima y ubica en posición a la molécula de substrato de modo que el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relación al sitio activo de la enzima.

2.6. Isoenzimas (6,9).

Los isoenzimas constituyen formas moleculares múltiples de una misma enzima que catalizan fundamentalmente la misma reacción, pero difieren en sus propiedades químicas, físicas, estructurales o inmunoquímicas; Se originan estas diferencias en su biosíntesis, debido a causas genéticas. Su diferencia radica en la estructura primaria de su proteína, ocurriendo como dímeros o tetrámeros, compuestos ya por subunidades idénticas o no.

Muchas enzimas existen en la misma especie o tejido y aun dentro de la misma célula. A menudo limitadas a un órgano, pueden pertenecer, sin embargo, también a organismos diferentes (enzimas isodinámicas).

Uno de los ejemplos más conocidos de isoenzimas es el de la dehidrogenasa láctica que está presente en los tejidos animales en 5 formas, separables por electroforesis. Estas 5 isoenzimas están constituidas por la combinación de dos clases diferentes de cadenas polipeptídicas, de un peso molecular de 33.500 cada una: Las cadenas "M" (de músculo) y "H" (de heart, corazón).

Para identificar y diferenciar isoenzimas se usan métodos cromatográficos (en columna); electroforéticos (en papel o gel); inhibidores químicos (ditio-treitol) o los respectivos antisueros contra isoenzimas. Estos últimos representan anticuerpos inhibidores obtenidos por vía inmunológica (de sueros ovinos o caprinos) que actúan generalmente por precipitación en la solución reactiva, al ser insoluble el complejo enzima - antisuero.

La identificación y diferenciación de isoenzimas tiene aplicación en el diagnóstico de ciertas enfermedades para poder localizarlas en un determinado órgano como, por ejemplo, en el infarto cardiaco, mediante las isoenzimas de la creatin-fosfokinasa (CPK).

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