2. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD DE PEROXIDASA Y DE SU REGENERACIÓN.

 

a) La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidación de ciertos compuestos dadores de hidrógeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromáticas (o-fenilendiamina) por medio de peróxidos (). El substrato oxidable más usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa:

La velocidad de formación del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad enzimática por lecturas espectrofotométricas de las absorbancias en relación con el tiempo.

La peroxidasa presenta como grupo prostético un grupo Hem, cuyo átomo central de hierro forma complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibiéndose su actividad enzimática.

La actividad enzimática depende del vegetal (los rábanos picantes son especialmente activos), del substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.

Como la mayoría de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisa mayor temperatura y más tiempo para su inactivación. Posee, además, la propiedad peculiar de la regeneración enzimática. Este fenómeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad después de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado, aduciendo que la fracción proteica de la enzima sufre una desnaturalización sólo parcial, con pérdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, produciéndose luego una reversión de la proteína a su estado normal por recombinación de sus grupos hidrógenos o sulfhidrílicos.

Este efecto del calor sobre la actividad peroxidásica es muy, importante en la industria de alimentos y la regeneración enzimática de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres organolépticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimática puede detenerse totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneración es muy débil generalmente.

La investigación de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o blanqueo de verduras y también en el control de pasteurización de la leche. Así, a la temperatura de pasteurización, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es sobrecalentada (más de 80-85°C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.

b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de al 0,9% y 4,7 ml de agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotómetro colocar 1 ml de jugo de expresión de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y agua oxigenada (a) al tubo del espectrofotómetro y tomar el tiempo con cronómetro. Vaciar rápidamente la mezcla al tubo vacío y luego nuevamente al tubo del espectrofotómetro. Colocar el tubo en el espectrofotómetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas de absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 ó 5 puntos. Graficar las lecturas de absorbancia contra los tiempos para obtener así la graduación de la reacción.

c) Regeneración: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de ensayo. Colocarlos en un baño hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo después, de 30 segundos, el 20 después de 1 minuto y el 39 después de 2 minutos. Enfriarlos rápidamente en un baño de agua y determinar de inmediato la actividad peroxidásica, como Se ha descrito anteriormente. Después de 1 hora repetir la determinación de la actividad en los tres tubos calentados.

2.1. DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA EN VEGETALES (59, 60, 61, 62).

Fundamento del método:

El método se basa en la oxidación del guayacol (incoloro) a tetraguayacol (rojo ladrillo). El substrato es el guayacol-peróxido de hidrógeno y la reacción es catalizada por la enzima peroxidasa.

Obtención del extracto crudo (de arvejas, porotitos verdes)

Se homogeneiza la muestra (60 a 150 g) en un omni-mixer a velocidad máxima por espacio de 3 minutos, manteniendo la temperatura a 0°C en baño de hielo. El extracto se obtiene en tampón de citrato 0,6 M a pH 4,5 (3 ml por g de tejido) y más o menos 1 g de carbonato de calcio.

La centrifugación se hace en una centrífuga tipo Sorvall a 0°C y a velocidad de 12.000 rpm durante 10 minutos. Algunos autores saturan la muestra con , usando un tubo de vidrio corriente. Se filtra el extracto a través de algodón, descartando los primeros 10 a 20 ml del filtrado.

Reactivos:

a) Nitrógeno (de cilindro).
b) Citrato tampón (pH 4,5) preparado de la siguiente forma:

-Disolver 126 g de ácido cítrico en más o menos 800 ml de agua dest.
-Agregar suficiente sol. de NaOH para llevar el pH a 4,5 (solución 7,5 N de NaOH). Enrasar a 1.000 ml; la concentración del citrato es de 0,6 M.
-Agregar unos ml de tolueno como preservativo, agitar y usarlo diluido con parte igual de agua dest. Guardar en refrigerador para retardar el desarrollo de hongos.

c) Solución de guayacol 0,5% en alcohol de 50%.
d) Agua oxigenada al 0,085% ó 0,05 N (diluir a un litro con agua dest., 2,83 ml de agua oxigenada de 30%). Guardar en refrigerador, preferiblemente en frasco obscuro, y renovarla semanal o mensualmente, dependiendo de la frecuencia de su uso.

Procedimiento:

En un tubo de ensayo que contiene 20 ml de agua dest., agregar 2 ml del extracto enzimático. Agregar 1 ml del reactivo de guayacol, dejándolo escurrir por las paredes del tubo, para formar una capa intermedia.

Se agrega 1 ml de la sol. de agua oxigenada al 0,085%, del mismo modo que el reactivo anterior.

Se tapa el tubo, se invierte rápidamente 2 ó 3 veces para mezclar bien y se coloca en la forma más rápida en el tubo del colorímetro Klett-Summerson, leyendo a 420 nm. Previamente el aparato debe ajustarse a 0 con agua dest. a la misma longitud de onda. La medición periódica de la intensidad de color desarrollado se hace por triplicado.

La reacción es lineal en el tiempo hasta los 15 min., considerándose el mejor tiempo los 5 minutos.

La actividad de peroxidasa se expresa como unidades KLETT/mg de proteína por 5 minutos de reacción.

Determinación de proteína:

Si se trata de extracto opaco, se recomienda la determinación por el método turbidimétrico (70). Pueden aplicarse también otros métodos de valoración de proteínas.

La enzima más usada para evaluar el grado de escaldado es la peroxidasa. Las principales razones para este uso son las siguientes:

-su presencia en cantidad considerable en prácticamente todos los alimentos que requieren del proceso de escaldado;
-su estabilidad al calor;
-su actividad puede ser fácilmente evaluada también por métodos simples y rápidos, como su extracción semicuantitativa que es una simplificación del método cuantitativo anteriormente señalado, en que se detecta visualmente el color a los 3,5 minutos de reacción. Para ello se miden:

1 ml de sol. de guayacol;
1 ml de sol. de agua oxigenada;
0,1 ml de extracto enzimático, y
21,9 ml de agua.

Se incuba a 25°C y se va observando el desarrollo o no de color rojo, medible a 460 nm (61, 62).

2.2. En forma semejante se procede a la determinación de la LACTOPEROXIDASA para el control de la pasteurización, sobrecalentamiento o esterilización de leche: a 3 ml de leche se agregan 3 ml de solución de guayacol al 1 %, en alcohol de 50% y 3 gotas de agua oxigenada. Dentro de 5 minutos se produce color rojo o salmón en leche cruda o pasteurizada a baja temperatura, siendo su límite térmico de 75 a 82°C.

2.3. DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA EN ALIMENTOS QUE LA CONTIENEN EN PEQUEÑAS CANTIDADES (por ejemplo, en maíz dulce) (75).

Fundamento:

Este método de valoración de la enzima peroxidasa se basa en medir el color desarrollado al reaccionar la enzima sobre la o-fenilendiamina, en presencia de peróxido de hidrógeno, leyéndose la absorbancia a 430 nm.

Reactivos:

a) Solución tampón de pH 6,5 (fosfato-citrato).
Se prepara mezclando 14,2 partes de fosfato disódico 0,2 M y 5,8 partes de ácido cítrico 0,1 M.
b) Orto-fenilendiamina al 1 % (en alcohol al 95%; se debe preparar fresca cada 4 horas).
c) Agua oxigenada al 0,3%.
d) Solución saturada de bisulfito de sodio.

Procedimiento:

Se pesan aproximadamente 4 g de material fresco y se lleva a 250 ml con tampón fosfato-citrato (a) de pH 6,5 y se somete a homogeneización en mezcladora eléctrica por 3 minutos; 10 ml de este extracto se llevan a 250 ml con el mismo tampón.

Una alícuota de 25 ml de la muestra homogeneizada y diluida se transfiere a una botella centrífuga de 250 ml. Por otra parte, 25 ml de alícuota de cada muestra se usan para preparar los blancos. Debe mezclarse bien antes de tomar las alícuotas, pues parte de la enzima se localiza en las partículas sólidas que tienden a sedimentar. Las muestras se mantienen en baño a t° constante de 25°C por 30 min.

A continuación, a la muestra problema se le agrega 1 ml de solución de o-fenilendiamina al 1 % y 1 ml de al 0,3%, dejándose la mezcla reaccionar por 5 minutos. A este tiempo debe detenerse la reacción agregando 2 ml de la solución saturada de bisulfito de sodio.

A los blancos se les agrega la fenilendiamina, luego el bisulfito y, por último, el agua oxigenada. La enzima es inhibida por el bisulfito de modo que ella está inactivada cuando se agrega el peróxido de hidrógeno.

Cuando se trata de productos ricos en almidón, es aconsejable precipitarlo, agregando para ello 25 ml de alcohol de 95%; se agita mientras se agrega el alcohol para lograr una buena floculación.

Las muestras se centrifugan a 3.000 rpm por 5 minutos. El supernadante se presenta como una solución clara y se transfiere a un tubo del colorímetro.

Se lee la absorbancia a 430 nm. El colorímetro se lleva a 100% de transmitancia con el correspondiente blanco de cada muestra.

Si se pesan 4 g de material fresco y se obtiene una lectura de 0,5, el resultado se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:

Cuando se toman cantidades mayores y se hacen diluciones menores, los valores de U/g se pueden calcular de la misma manera.

2.4. DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA EN VEGETALES CONGELADOS (68).

Reactivos estables:

a) Solución tampón de fosfato-oxalato 0,1 M, pH 6,0: Disolver 14,2 g de (o 26,81 g de + 7) y 12,6 g de + 2 en agua y calentar; enfriar, ajustar el pH a 6,0 con hidróxido de sodio 1 N y diluir a 1 litro.
b) Solución de ácido oxálico 1 M: Disolver 126 g de ácido oxálico en agua y diluir a 1 litro.
c) Solución de cloruro de sodio al 2%: Disolver 20 g de NaCl en agua y diluir a 1 litro. Enfriar a 0°C y mantenerlo a esa temperatura.

Reactivos relativamente inestables:

d) Solución de agua oxigenada 0,1 N: Diluir 0,58 ml de agua oxigenada al 30% a 100 ml con agua. Estandarizarla yodométricamente como sigue: a 25 ml de agua oxigenada 0,1 N agregar 10 ml de ácido sulfúrico 4 N, 6 ml de KI 1 N y 3 gotas de molibdato de amonio 1 N. Titular con solución de tiosulfato de sodio 0,1 N, usando almidón como indicador. Esta solución debe mantenerse en refrigeración cuando no se use. Debe prepararse semanalmente.

e) Solución de indo-fenol 0,001 N: Disolver 200 mg de 2,6-diclorofenol-indofenol o 175 mg de su sal sódica, en agua y diluir a 1 litro. Estandarizarla contra tiosulfato de sodio 0,01 N titulando el yodo liberado con 50 ml del colorante después de adicionar 10 ml de KI 1 N y 10 m1 de H2SO4 4 N. Mantener en refrigeración y prepararla cada semana.

f) Solución de ácido ascórbico 0,05 M: Disolver 880 mg de 1-ácido ascórbico en tampón (a) 0,1 M y diluir a 100 ml. Prepararla fresca todos los días.

Preparación del extracto enzimático:

Homogeneizar 50 g de material fresco o congelado en una mezcladora a alta velocidad con 200 ml de la solución de cloruro de sodio al 2%, fría. Eliminar las partículas mayores, por filtración, a través de gasa. Usar esta solución dentro de 30 minutos.

Procedimiento:

En un vaso de 400 ml colocar: 75 ml de tampón (a), 50 ml del colorante (e), 5 ml de ácido ascórbico (f) y suficiente cantidad de agua (para alcanzar un total de 250 ml después de adicionar el extracto en ensayo y agua oxigenada). Calentar a una temperatura de más o menos 25°C o enfriar en caso de bajarla a la misma temperatura.

Colocar el vaso en un agitador magnético y agitar por 30 segundos, a una velocidad tal de impedir la penetración de aire. Agregar a continuación 1-3 ml del extracto enzimático problema (equivalente a 0,2-0,4 g de tejido) y rápidamente agregar 5 ml de . Poner en función el cronómetro inmediatamente después de agregar el agua oxigenada. Continuar mezclando a medida que se agrega el agua oxigenada y hasta que se retire la primera alicuota.

Dentro de los 15-30 segundos después de agregar el agua oxigenada, medir 25 ml de la mezcla reaccionante con una pipeta de flujo rápido de tal manera de poder expulsar el contenido en 5 segundos y hacerlos caer en 5 m1 de la solución de ácido oxálico (b) colocados en un Erlenmeyer de 125 ml. Tomar 4-5 muestras consecutivas a 1 minuto de intervalo y vaciar en otros matraces de 125 ml que contiene cada uno 5 ml de ácido oxálico (b).

Registrar el tiempo de reacción que corresponde al tiempo que deplore en vaciarse la pipeta. Titular el ácido ascórbico residual con la solución de indo-fenol y calcular la reacción de primer orden. Ajustar la actividad enzimática de modo que la constante sea de la magnitud de 5-20 x y expresar la actividad de peroxidasa Kf como de tejido usado.

Los puntos finales deben ser rosados claramente visibles y permanecer por espacio de 1 minuto. Todas las titulaciones deben asemejarse a la primera en su limite. Agregar el indo-fenol en forma rápida al comienzo y posteriormente en forma más lenta.

ta y tb son tiempos iniciales y finales de dos titulaciones bajo las condiciones estipuladas.

Bajo condiciones óptimas el valor de la titulación inicial es de 35-40 ml de colorante y los valores disminuyen a 20-25 m1 en 5 minutos.

Este es el método de cálculo que se aplica en la determinación de catalasa, pero también puede tomarse la recta (slope of plot) del logaritmo de los ml de colorante versus tiempo. Dividir el promedio del valor de para los diversos intervalos de tiempo (0-1, 1-2, 2-3 minutos) por el peso del tejido vegetal, correspondiendo al vol. de extracto en la mezcla de reacción.