3. DETERMINACIÓN DE CATALASA EN VEGETALES.

 

Reactivos relativamente estables:

a) Solución fosfato tampón 0,1 M, pH 6,95 ± 0,15: Disolver 15,22 g de en agua y diluir a 1 litro.
b) Acido sulfúrico con molibdato 2N: Agregar 55 ml de a más o menos 800 ml de agua, enfriar y agregar 0,1 g de molibdato de amonio finamente molido .
c) Solución de tiosulfato de sodio (más o menos 0,01N) en solución de yoduro de potasio al 10%: Disolver 100 g de KI, 2,50 g de y más o menos 1 g de carbonato de sodio en 500 ml de agua; diluir a 1 litro (no es necesario estandarizar).
d) Solución de yodo 0,01 N: Disolver 1,27 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio: en 10 ml de agua y diluir a 1 litro: Se estandariza contra una solución de tiosulfato de sodio. Evitar exponerla a la luz excesiva, aun cuando esté en la bureta.

Reactivos relativamente inestables:

e) Peróxido de hidrógeno 0,1 N: Diluir 0,58 ml de agua oxigenada al 30% a, .100 ml con agua fría. Guardar en refrigerador o baño, de hielo cuando, no esté en uso. Preparar diariamente.
f) Solución de glucosa al 20% en solución tampón: Disolver 20 g de glucosa en 100 ml de fosfato 0,1 M (a). Guardar en refrigerador y prepararla semanalmente.
g) Indicador de almidón: Suspender 1 g de almidón en 100 ml de agua fría, agitar y calentar a ebullición. Preparar cada dos semanas.

Preparación de las muestras (extractos):

Para evitar contaminación con metales pesados, manejar las muestras sólo con espátulas de ácero inoxidable.

a) Vegetales congelados o frescos: 50 g del producto se homogeneizan a alta velocidad por 3 minutos con más o menos
1 g de carbonato de calcio y suficiente agua como para completar 200 ml. Eliminar las partículas, filtrando por gasa. Usar el filtrado dentro de 30 minutos.
b) Vegetales secos: Rehidratar 5 g de la muestra y proceder a la extracción como en a).

Determinación:

a) Demostrar presencia o ausencia de catalasa: A 10 ml de extracto (o menos, dependiendo de la actividad) agregar agua hasta un volumen de 43 ml y 5 ml de la solución de glucosa (f). Mezclar y agregar 2 ml de 0,1 N. Inmediatamente después de agregar el agua oxigenada, mezclar rápidamente; de inmediato sacar una alícuota (que va a corresponder al tiempo cero) con una pipeta de succión rápida y vaciar en un Erlenmeyer de 125 ml que contiene 10 ml de molibdato (b). Empezar a contar el tiempo cero desde que se sacó la alícuota de tiempo cero. Sacar 10 ml de la alícuota a los 5 y 10 minutos (La temperatura de la mezcla de reacción debe permanecer a menos de 20°C).

A cada tiempo, dentro de 1 hora, agregar a cada matraz 5 ml de tiosulfato-yoduro (c) y mezclar. Dejar en reposo 3 a 5 minutos; en seguida titular el exceso de tiosulfato con solución de yodo 0,01 N, usando 10 gotas de almidón como indicador.

Correr un blanco de la misma manera, excepto agregar agua en lugar del agua oxigenada y no sacar alícuotas a los 5 y 10 minutos.

La diferencia entre los valores del blanco y los obtenidos en presencia de agua oxigenada corresponde a la solución de yodo, equivalente al agua oxigenada presente en los respectivos tiempos. El valor del tiempo cero deberá ser 0,5 a 2,0 ml de sol. de yodo; diferencias entre el blanco y el tiempo cero serán entre 3,0-4,5 ml de sol. de yodo 0,01 N.

3.1. Determinación de catalasa en solución.

Las condiciones del test son:

1 ml de 0,06 M en tampón de fosfato, 0,05 M de pH 7,0 se mezcla con 2 ml de catalasa o del extracto problema (1,25 m g/ml) disuelto en tampón de fosfato 0,05 M de pH 7,0 a 25°C y se mide E240/min, haciendo la lectura cada segundo durante los primeros 70 segundos de la reacción. Una unidad de catalasa corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones del ensayo transforma 1 mol de substrato por minuto.

3.2. Determinación de catalasa en leche.

La determinación de presencia de catalasa junto con la reductasa sirve para conocer el estado de conservación de la leche, pues con el número de gérmenes aumentan también las catalasas y reductasas que ellos producen.

En un catalasímetro apropiado que permite medir el volumen de oxígeno que se desprende, se colocan 10 ml de leche y 5 ml de agua oxigenada (3%). Se lleva durante 2 horas a 37°C y se mide el volumen gaseoso que sé desprende, expresando el resultado en ml de O2%. En el catalasímetro de Roeder se usan 5 ml de leche mas 1 ml de agua oxigenada al 1,67°0 (obtenida por mezcla de 10 ml de 30% o con 140 ml de agua), adicionada de dibromotimol, indicador de pH cuyo viraje se reconoce por la coloración que toma la mezcla (reacción alcalina: azul-verdoso; ácida: verde-oliva a amarillo). Aquí el volumen se mide después de 30’ a 37°C. La leche normal cruda desprende hasta 30 ml de %, la pasteurizada hasta 6 ml y la leche cocida o esterilizada no presenta desprendimiento. Las leches enfermas, sucias o calostrales desprenden hasta 10 ó 15 veces mas que una leche normal.