5. DETERMINACIÓN DE FOSFATASA EN LA LECHE.

 

a) El método más usado se basa en la hidrólisis del disodio-fenilfosfato por acción de la fosfatasa de la leche con liberación de fenol, el cual sé reconoce al hacerlo reaccionar con la dibromoquinon-clorimida, dando indofenol de color azul:

Reactivos necesarios: Solución tampón de bórax: 28,427 g de bórax crist. (p.an.) se disuelven en 900 ml de agua, se agregan 3,27 g de NaOH y se completa 1 litro con agua (pH 9,6).

Reactivo BQC: 40 mg de 2,6-dibromo-quinona-4-clorimida (Merck: para determinar fosfatasa en leche) se disuelven en 10 ml de etanol.

Substrato tampón (de preparación reciente): 0,5 g fenilfosfato sal disódica, dihidrato (Merck: para determinar fosfatasa en leche) se disuelven en 5 ml de agua, se agregan 100 ml del tampón de bórax y se completa 1 litro con agua, debiendo tener un pH de 9,6 (azul a la timolítaleina). [Si sé desea comprobar la ausencia de fenol libre, la solución del fenilfosfato en los 5 ml de agua se agita con 0,5 m1 de tampón de bórax y luego con 4 gotas de reactivo BQC. Si en 10’ resulta color azul, se extrae éste con 2 ml de butanol y se usa él liquido inferior, ahora decolorado, agregando los 100 ml de bórax y completando el litro con agua.

Técnica: 10 ml de substrato tampón se adicionan de 1 ml de leche, bien homogeneizada por inversión repetida, pues los glóbulos grasos adsorben mucha fosfatasa. Se agita y se incuba a 41 °C (37-45°C) durante 10’ (Scharer indica 38-40°C durante 1 hora); luego se hierve (o se calienta a 80°C durante 5’), se enfría, se agregan 5-10 gotas de reactivo BQC y se deja reposar por lo menos 5’. Debe hacerse simultáneamente una prueba en blanco con leche calentada a 80°C durante 5' para inactivar la fosfatasa. Pruebas en blanco sin leche o sin substrato tampón deben resultar también negativas.

Como la cantidad de fenol liberado es proporcional a la actividad fosfatásica y, por lo tanto, a la intensidad del color azul, se le puede dar también una apreciación cuantitativa (68), midiendo su extinción a 660 nm y haciendo la lectura en una curva de calibración que confronta los mcg de fenol con las extinciones obtenidas. E1 limite térmico es de 72-73°C, de manera que una leche stassanizada da generalmente resultado negativo. Según Scharer, una leche correctamente pasteurizada no debe desprender más de 15 mcg de fenol por ml.

En la mantequilla se incuba 1 g con 10 ml del substrato y en el queso se trabaja con el macerado de 1 g en 10 ml del substrato, después de ajustar el pH a 9,6.

b) Otra técnica (49) usa como reactivo el disodio-p-nitrofenilfosfato, que es hidrolizado por la fosfatasa a p-nitrofenol, de color amarillo. 5 ml de un substrato tampón (con 0,15 g de 4-nitrofenilo-fosfato, sal disódica, disuelta en un tampón con 3,5 g de anhidro y 1,5 g de por litro de agua) se mezclan con 1 ml de leche y se calienta a 37°C por 30 min. El color resultante se puede comparar con los discos de colores estándares de un comparador de Lovibond, graduados en g de p-nitrofenol por ml de leche. La leche pasteurizada da 0 o trazas de g hasta 10 m g, si se incuba 90 min. más.