17. DETERMINACIÓN DE UREASA (53).

 

Fundamento:

Como la reacción que cataliza esta enzima sobre la urea es la liberación de amoniaco, la determinación se basa en la cuantificación de éste, bajo las condiciones de ensayo.

Reactivos:

-Substrato: solución de urea 0,17 M en agua bidestilada, a 30°C (pH 6,1).
-HC1 0,1 N.

Preparación del extracto problema:

El material a ensayar (poroto de soya) se muele, y se extrae la enzima con agua destilada a temperatura de 30°C. Se filtra o centrifuga, usándose el sobrenadante para la determinación de la actividad enzimática.

Procedimiento:

Se colocan 50 ml del substrato en un matraz Erlenmeyer y a continuación se agrega una alícuota del extracto en estudio, manteniendo la mezcla a 30°C por espacio de 10 minutos.

Se valora el amoníaco liberado con HC1 0,1 N, ajustando el pH a 6,1 con ayuda de un potenciómetro.

Unidad enzimática:

1 U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo disocia 1 micromol de urea por minuto.

UNIDADES ESPECÍFICAS PARA ALGUNAS ENZIMAS USADAS EN ALIMENTOS (43, 53).

Alfa-amilasa (bacteriana, pancreática) y Beta-amilasa:

1 Unidad = cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test, libera un microequivalente de grupos reductores (de los enlaces glucosídicos) por minuto (calculado como maltosa).

Alfa-amilasa (de vegetales):

1 Unidad (SKB) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test desdobla a 30°C 1 g de amilodextrina en 1 hora, de modo que por adición de yodo se obtenga igualdad de coloración con un color estándar.

Amiloglucosidasa y Celulasa:

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera 1 microequivalente de grupos reductores por minuto (calculado como glucosa).

Celulasa:

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 35°C hace bajar la viscosidad de carboximetil-celulosa de 400 a 300 cp en 1 hora.

Glucosa-oxidasa:

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test cataliza la transformación de 1 m mol de substrato por minuto.

1 Unidad = la cantidad de enzima que bajo las condiciones del test a 30°C, a pH 5,9 y con exceso de catalasa produce la captación de 100 mm de sobre el substrato de glucosa.

Invertasa:

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 20°C hidroliza el 77% de la sacarosa aplicada.

Catalasa (fúngica, bacteriana, animal):

1 Unidad (Baker) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 25°C desdobla 266 mg de peróxido de hidrógeno por minuto.

Lactasa (fúngica):

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera por minuto 1 micromol de o-nitrofenol a partir de o-nitrofenol-beta-D-galactósido.

Lipasa (pancreática, fúngica):

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test libera a partir del substrato 1 microequivalente (micromol) de ácido por minuto.

Pectinasa (bacteriana):

1 Unidad = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 30°C produce en un substrato de pectina de Citrus un aumento de extinción de = 0,01 por minuto a 235 nm.

Proteasas:

En general, se usa la Unidad Anson (véase Pág. 13) con hemoglobina como substrato. Además:

a) Vegetal (papaína, bromelina, ficina): 1 Unidad NF (National Formulary) = cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test y a 40°C libera 1 m g de tirosina por hora, a partir de un substrato de caseína.
b) Fúngica: 1 Unidad HUT = cantidad de enzima que bajo las condiciones del ensayo y a 40°C libera 1 m g de tirosina por ml y minuto a partir de substrato de hemoglobina.
c) Bacteriana: 1 Unidad (PC) = cantidad de enzima que bajo las condiciones del test y a 37°C libera 1 m g de tirosina por minuto a partir de caseína.